以环糊精为偶联剂的单抗药物偶联物制造技术

以环糊精分子为偶联剂，以适当方法获得抗Ⅳ型胶原酶单抗３Ｄ６Ｆａｂ’片段，将Ｆａｂ’片段与平阳霉素偶联，获得偶联物Ｆａｂ’－平阳霉素，分光光度法测定结果表明偶联物分子量为６８ｋＤａ，偶联物对人口腔鳞癌ＫＢ细胞、小鼠肝癌２２细胞等呈阳性免疫反应，以克隆形成法检测偶联物对体外培养的ＫＢ细胞的杀伤作用，结果表明偶联物对靶细胞ＫＢ的作用强于平阳霉素，体内实验用肝癌２２模型，Ｆａｂ’－－平阳霉素偶联物抑制肝癌生长作用明显强于等剂量平阳霉素，确定以环糊精作为偶联剂可制备新型、有效的抗肿瘤单抗导向药物并用于肿瘤治疗。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种以环糊精分子作为偶联剂，将单克隆抗体(单抗)与药物进行偶联并用于肿瘤治疗的方法。环糊精(cyclodextrin)是一种小分子葡聚糖，包括α、β和γ三种，分子量为分别为973、1135和1297Da。为提高单抗药物偶联物对肿瘤组织的穿透力，增强抗肿瘤作用，需将偶联物分子小型化。已报道，以葡聚糖T-40为偶联剂构建的完整单抗或单抗Fab’片段与抗肿瘤抗生素平阳霉素(PYM)偶联物，其分子量分别为270kDa和170kDa；两种偶联物均有较游离PYM更强的抗肿瘤作用(药学学报2000,35:649)。但未见将单抗Fab’片段与PYM偶联物分子进一步裁小的报道。据报道，β-环糊精与二苯基乙酸的偶联物与盲肠和结肠的内容物共同孵育，可释放出β-环糊精和二苯基乙酸，但偶联物与胃和小肠的内容物共同孵育时，却非常稳定，表明β-环糊精与药物的共价偶联物可作为靶向药物载体(Journal of Pharmacy and Pharmacology,1996,48:27)。β-环糊精与甲氧基-甘氨酸-甘氨酸-亮氨酸-(2S,3S)-环氧琥珀酸-亮氨酸-脯氨酸偶联物对肿瘤细胞有良好的靶向性，该偶联物可与氨甲蝶呤形成共合物(Bioorganic and Medicinal ChemistryLetter,2000,10:677)。表明环糊精分子是良好的靶向药物载体，但迄今为止，国内外均未见以环糊精分子作为单抗与药物连接的偶联剂的报道。本项专利技术的研究表明，以环糊精分子为偶联剂构建的单抗活性片段与药物的偶联物不仅具有分子量小的特点，而且具有明显抗肿瘤作用，有可能成为新型的抗肿瘤单抗导向药物。本专利技术的目的是以环糊精分子作为偶联剂，制备分子小型化的单抗活性片段与平阳霉素偶联物，用于临床治疗肿瘤。本专利技术的内容与要点是1．单抗3D6的Fab’片段制备小鼠抗Ⅳ型胶原酶单抗3D6用0.05mol/L的Tris缓冲液(含2mmol/L EDTA,1mmol/L半胱胺酸)调整为4mg/ml,pH7.2。加入适量无花果蛋白酶，37℃反应6小时，产物经Sephadex G-150层析纯化获得F(ab’)2片段。F(ab’)2片段经β-巯基乙醇还原和Sephadex G-75层析纯化获得Fab’片段，其分子量约为53kDa。2．Fab’片段与平阳霉素偶联物的制备β-环糊精经高碘酸钠氧化后以Sephadex G-10纯化，去离子水洗脱。收集仅与斐林试剂反应而与硝酸银无反应的洗脱液部分，冷冻干燥，得多醛基β-环糊精(PAC)。按一定比例将PAC与PYM共溶于适量磷酸盐缓冲液(PBS)中，4℃避光搅拌12小时，加入单抗Fab′片段继续反应12小时。0.3mol/L硼氢化钠还原2小时，以截留分子量为10kDa的透析袋搅拌透析24h，透析内液即为偶联物Fab’-平阳霉素。3．偶联物中单抗Fab′片段、环糊精及PYM的含量以分光光度法测定偶联物中各组分含量并计算分子比和偶联物分子量。结果表明，偶联物中Fab′片段、环糊精及PYM的分子比为1∶2.4∶7.3，偶联物分子量为68kDa。4．偶联物免疫活性偶联物免疫活性用ELISA法进行测定。偶联物与人体肺癌PG细胞、口腔鳞癌KB细胞及小鼠肝癌22细胞(H22)均呈免疫学阳性反应，但与肝癌BEL-7402细胞无反应，表明偶联物对肿瘤细胞的反应具有选择性(图1)。5．偶联物对体外培养的肿瘤细胞的作用体外培养的KB和BEL-7402细胞，用克隆形成法测定，药物作用1小时。偶联物对靶细胞KB的作用强于游离平阳霉素，二者抑制50％克隆形成的浓度(IC50)分别为0.02μmol/L和0.42μmol/L；偶联物对非靶细胞BEL-7402的作用略低于游离平阳霉素，IC50分别为0.51μmol/L和0.17μmol/L。表明偶联物对靶细胞具有选择性杀伤作用(图2，图3)。6．偶联物对动物皮下移植肝癌22的治疗作用昆明小鼠皮下接种1.5×106个细胞。至第7天，肿瘤直径达4-5mm，此时分组并开始治疗。静脉注射平阳霉素或偶联物，隔日给药一次，共5次。实验期间每两天测定一次肿瘤大小，以公式1/2ab2(a肿瘤长径；b肿瘤短径)计算肿瘤体积。实验第21天处死动物，称皮下瘤重，计算抑瘤率。结果表明，治疗期间，生理盐水对照组肿瘤生长迅速，平阳霉素和偶联物对肿瘤生长有抑制作用；停止治疗后，平阳霉素组肿瘤生长较快，但偶联物对肿瘤生长仍有抑制作用(图4)。实验第21天，对照组和平阳霉素治疗组肿瘤分别达9.90±1.80g和8.47±1.19g，偶联物治疗组肿瘤分别为2.67±1.64g和1.87±0.92g，表明偶联物有明显抑瘤作用(表1)。表1偶联物对小鼠肝癌22的抑制作用 皮下接种肿瘤，静脉给药，两天一次；**p＜0.01与对照组比较△△ p＜0.01与平阳霉素组比较7．Fab′-CD-PYM偶联物对动物主要脏器的影响病理组织切片结果显示，实验所用剂量的偶联物，动物心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠和股骨均未见毒性病变。本专利技术的优点和积极效果是确定了一种新的制备单抗药物偶联物方法。平阳霉素是临床常用的抗肿瘤药物，以环糊精分子为偶联剂构建的平阳霉素与单抗活性片段偶联物具有分子量小的优点，而且抗肿瘤作用明显强于游离平阳霉素，有可能开发成新型抗肿瘤导向药物用于临床肿瘤治疗，并取得良好疗效。 附图说明图1单抗Fab’-平阳霉素偶联物与PG、KB、H22和BEL-7402细胞的免疫反应性其中横坐标为抗体浓度(mg/ml)纵坐标为490nm吸光值1为人肺癌PG细胞2为人口腔鳞癌KB细胞3为小鼠肝癌22细胞4为人肝癌BEL-7402细胞图2平阳霉素及Fab’-平阳霉素偶联物对KB细胞的抑制作用其中横坐标为平阳霉素浓度(μmol/L)纵坐标为克隆形成率(％)1为平阳霉素2为Fab’-平阳霉素偶联物图3平阳霉素及Fab’-平阳霉素偶联物对BEL-7402细胞的抑制作用其中横坐标为平阳霉素浓度(μmol/L)纵坐标为克隆形成率(％)1为平阳霉素2为Fab’-平阳霉素偶联物图4平阳霉素及Fab’-平阳霉素偶联物对小鼠皮下接种肝癌22的抑制作用其中横坐标为接种后天数(天)纵坐标为肿瘤体积(cm3)1为对照2为10mg/kg剂量的平阳霉素3为5mg/kg剂量的Fab’-平阳霉素偶联物4为10mg/kg剂量的Fab’-平阳霉素偶联物权利要求1．以环糊精为偶联剂的单克隆抗体(单抗)药物偶联物，其特征是所说的偶联物的实施包括以下步骤A．单抗3D6的Fab’活性片段的制备；B．以环糊精分子为偶联剂将Fab’片段与平阳霉素偶联；C．Fab’-平阳霉素偶联物分子构成和分子量测定；D．Fab’-平阳霉素偶联物抗肿瘤作用的检测；2．按照权利要求1所述的偶联物，其特征是利用抗Ⅳ型胶原酶单克隆抗体3D6制备Fab’片段。3．按照权利要求1所述的偶联物，其特征是Fab’片段与平阳霉素偶联物的制备是先将环糊精分子以高碘酸钠氧化，再分别与Fab’片段及平阳霉素偶联，经透析获得Fab’-平阳霉素偶联物。4．按照权利要求1所述的偶联物，其特征是体外培养的人体口腔鳞癌KB细胞和肝癌BEL-7402细胞，用克隆形成法检测平阳霉素及Fab’-平阳霉素偶联物对肿瘤细胞的抑制本文档来自技高网...

【技术保护点】
以环糊精为偶联剂的单克隆抗体（单抗）药物偶联物，其特征是所说的偶联物的实施包括以下步骤：Ａ．单抗３Ｄ６的Ｆａｂ’活性片段的制备；Ｂ．以环糊精分子为偶联剂将Ｆａｂ’片段与平阳霉素偶联；Ｃ．Ｆａｂ’－平阳霉素偶联物分子构成和分子量测 定；Ｄ．Ｆａｂ’－平阳霉素偶联物抗肿瘤作用的检测。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：甄永苏，刘小云，刘秀均，李毅，
申请(专利权)人：中国医学科学院医药生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]