Ｅｎｄｏｇｌｉｎ抗体偶联的脂质体及其制备方法和应用，涉及一种Ｅｎｄｏｇｌｉｎ抗体偶联的脂质体。Ｅｎｄｏｇｌｉｎ抗体偶联的脂质体包括纳米脂质体微粒、Ｅｎｄｏｇｌｉｎ抗体分子、将Ｅｎｄｏｇｌｉｎ抗体偶联在纳米脂质体微粒上的偶联剂以及纳米脂质体微粒装载的质粒ＤＮＡ／抗肿瘤药物／成像材料。先制备ＰＥＧ修饰的磷脂薄层，再装入质粒／药物／成像材料，制备纳米脂质体颗粒，然后将纳米脂质体颗粒的均一化和纯化，再巯基化Ｅｎｄｏｇｌｉｎ抗体，将Ｅｎｄｏｇｌｉｎ抗体分子偶联在ＰＥＧ修饰的纳米脂质体上。所述Ｅｎｄｏｇｌｉｎ抗体偶联的脂质体可在制备诊断和治疗实体肿瘤药物中应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种Endoglin抗体偶联的脂质体，尤其是涉及一种Endoglin抗体偶 联的脂质体及其制备方法和应用。
技术介绍
在肿瘤的诊断、药物治疗和基因治疗中，寻找理想的肿瘤靶点和靶向载体一直 是研究热点。Endoglin是20世纪80年代发现的一个和肿瘤新生血管相关的膜表面同型 二聚体糖蛋白分子(分子量约为180kDa)，是转化生长因子-β Ktransforminggrowth factor-β 1，TGF-β 1)和细胞表面受体结合时的辅助分子。Endoglin和TGF-β 1结合 后，可调节TGF-βΙ和其受体结合后下游的信号传导途径，从而促进肿瘤新生血管生 成。现已有许多研究表明Endoglin主要分布于新生血管的内皮细胞和肿瘤周围组织的 细胞表面，其它正常组织几乎均不表达。因此，Endoglin和肿瘤血管生成密切相关， 是肿瘤血管生成的标志性分子之一。由于不同组织来源的肿瘤新生血管均起源于内皮细 胞，各种肿瘤的新生血管具有均质性，所表达的特异抗原物质具有共性，这样就可避免 不同肿瘤由于遗传物质在不断突变所导致的不同组织起源的肿瘤抗原的异质性，因此针 对肿瘤新生血管的治疗手段有可能应用于各种肿瘤。可见，Endoglin是肿瘤抗血管治疗 和靶向治疗的理想靶点，具有诱人的临床应用前景。Pegylatedimmunoliposomes(PILs)是经聚乙二醇(PEG)修饰的、粒径控制在 100纳米左右的纳米免疫脂质体，是一种新的非病毒基因转移载体系统。在现有研究中，人 们已经将多种抗体结合在脂质体上，制备出各种不同用途的免疫脂质体材料。例如 2009年4月21日提交的中国专利技术专利申请200910103657.X公开了一种基于内皮抑素基 因的免疫脂质体及其制备方法和应用，该脂质体结合了抗第VIII因子相关抗原单克隆抗 体，可特异性作用于肺血管内皮细胞，抑制血管生成和肺纤维化形成。又如2009年7 月21日提交的中国专利技术专利申请200910100763.2公开了一种CD19单克隆抗体免疫脂质 体的制备及用途，该脂质体可以特异性作用于恶性B淋巴细胞和B淋巴细胞白血病干细 胞。然而，对于现有技术制备的用于肿瘤治疗的免疫脂质体材料所结合的抗体而 言，其特异性抗原均只存在于特定种类的肿瘤细胞中，故这类脂质体材料均只能针对特 定种类的肿瘤细胞具有靶向性，其适用范围也因此受到了极大限制。如果能够将前面所 述的Endoglin抗体与脂质体进行偶联，可以开发出一种新型的免疫脂质体材料，该材料 能够以各类肿瘤组织中广泛存在的新生血管内皮细胞为靶向，因而对各类肿瘤均具有良 好的靶向性。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种可以特异性作用于肿瘤组织的新生血管内皮细胞的Endoglin抗体偶联的脂质体。本专利技术的另一目的是提供所述Endoglin抗体偶联的脂质体的制备方法。本专利技术的另一目的是提供所述Endoglin抗体偶联的脂质体的应用。本专利技术所述Endoglin抗体偶联的脂质体包括纳米脂质体微粒、Endoglin抗体 分子、将Endoglin抗体偶联在纳米脂质体微粒上的偶联剂以及纳米脂质体微粒装载的质 粒DNA/抗肿瘤药物/成像材料；所述Endoglin抗体偶联的脂质体中，各组分的质量比 为纳米脂质体微粒Endoglin抗体分子偶联剂/装载的物质=(8 12) (0.8 1.2) (0.8 1.2) (0.1 0.3)。所述纳米脂质体微粒的粒径可为50 250nm。 所述Endoglin抗体分子可为单克隆抗体(monoclonal antibody, mAb)或单链抗体 (single-chain antibody, ScAb)，分子量可为 20 180k 道尔顿。所述纳米脂质体微粒装载的物质可选自携带抗肿瘤目的基因的质粒、蛋白质或 多肽、肿瘤治疗药物、肿瘤组织成像材料中的至少一种等，其包封率可为3% 70%， 载药量可为0.7% 3%。所述偶联剂可为聚乙二醇衍生物等，所述聚乙二醇衍生物可选自二硬脂酰磷脂 酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)或二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺 (DSPE-PEG-maleimide)等PEG衍生物，偶联剂的PEG的分子量可为1000 4000。本专利技术所述Endoglin抗体偶联的脂质体的制备方法包括以下步骤1)制备PEG修饰的磷脂薄层；2)装入质粒/药物/成像材料，制备纳米脂质体颗粒；3)纳米脂质体颗粒的均一化和纯化；4)巯基化 Endoglin 抗体；5)将Endoglin抗体分子偶联在PEG修饰的纳米脂质体上。在步骤1)中，所述制备PEG修饰的磷脂薄层的具体方法包括用三氯甲烷 将棕榈酰油酰磷脂酰胆碱、双十二烷基二甲基溴化铵、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二 醇2000和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺分别配制成20mg/mL、 5mg/mL、20mg/mL 禾口 10mg/mL 的相应浓度，并按 18.6ymol、0.6 μ mol> 0.6 μ mol 禾口 0.2 μ mol的量混合于样品瓶中；充分混勻后，通氮气流(时间应不少于IOmin)除去有机 溶剂，并不断旋转样品瓶，直至形成磷脂薄层；而后置于旋转蒸发仪中真空蒸发2h。在步骤2)中，所述装入质粒/药物/成像材料，制备纳米脂质体颗粒的具体方 法包括往步骤1)所述样品瓶中加入50mM、pH = 7.0的TRIS-HCL缓冲液0.2mL，轻 微旋转和震荡后，置水浴超声波仪处理3min，充分重悬磷脂混合物，同时应尽量避免气 泡的产生；依次逐滴加入待装载的物质350 μ g、终浓度为40% 80%的乙醇和200mM CaCl2溶液，并使乙醇的终浓度达到35% (V/V)、CaCl2的终浓度达到4mM ；将瓶盖旋紧 并密封，进行5个循环的反复冻融，得到质粒脂质体，其中，每一个冻融循环包括5min 液氮-2min 37°C水浴-4min室温静置；所述待装载的物质可选自携带抗肿瘤目的基因的 质粒、肿瘤治疗药物、肿瘤组织成像材料等中的至少一种。在步骤3)中，所述纳米脂质体颗粒的均一化和纯化的具体方法包括将步骤2) 得到的质粒脂质体依次通过膜挤出器中的400nm、IOOnm和50nm双层微孔滤膜各20次、20次和21次；在HEPES缓冲液中透析2h回收得到的质粒脂质体，期间更换透析液一次。在步骤4)中，所述巯基化Endoglin抗体的具体方法包括；将Endoglin抗体 1.6mg与200 μ L IOmM的Traut，s Reagent在避光室温巯基化反应lh，随后超滤3次， 除去Traut’ s Reagent的同时，将缓冲液置换成HEPES缓冲液；所述Endoglin抗体可为单克隆抗体或单链抗体，分子量可为20 180k道尔顿。在步骤5)中，所述将Endoglin抗体分子偶联在PEG修饰的纳米脂质体上的具体 方法包括将步骤4)得到的巯基化Endoglin抗体迅速加入步骤3)得到的脂质体颗粒中， 室温下氮气保护环境中，摇晃偶联反应过夜。所述Endoglin抗体偶联的脂质体对新生血管内皮细胞具有良好的靶向性，因此 所述Endoglin抗体偶联的脂质体可在制备诊断和治疗实体肿瘤药物中应用本文档来自技高网...
【技术保护点】
Ｅｎｄｏｇｌｉｎ抗体偶联的脂质体，其特征在于包括纳米脂质体微粒、Ｅｎｄｏｇｌｉｎ抗体分子、将Ｅｎｄｏｇｌｉｎ抗体偶联在纳米脂质体微粒上的偶联剂以及纳米脂质体微粒装载的质粒ＤＮＡ／抗肿瘤药物／成像材料；所述Ｅｎｄｏｇｌｉｎ抗体偶联的脂质体中，各组分的质量比为：纳米脂质体微粒∶Ｅｎｄｏｇｌｉｎ抗体分子∶偶联剂／装载的物质＝（８～１２）∶（０．８～１．２）∶（０．８～１．２）∶（０．１～０．３）。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：赵永祥，卓慧钦，卢小玲，
申请(专利权)人：赵永祥，
类型：发明
国别省市：45
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