本发明专利技术提供一种酶联免疫检测试剂盒，该试剂盒包括：包被有Ｔ－２毒素抗原的酶标板、酶标记物、Ｔ－２毒素特异性抗体、浓度已知的多个Ｔ－２毒素标准品溶液、底物显色液、终止液、洗涤液和复溶液；其中，所述Ｔ－２毒素抗原是通过将Ｔ－２毒素的Ｃ－３位衍生物与牛血清白蛋白进行偶联得到的，所述Ｔ－２毒素特异性抗体为使用所述Ｔ－２毒素抗原获得的鼠源单克隆抗体。本发明专利技术还提供使用上述试剂盒检测样品中Ｔ－２毒素的方法。本发明专利技术提供的试剂盒和检测方法具有不受检测设备的限制并且能够实现对大批量的Ｔ－２毒素样品进行快速检测的优点，同时对Ｔ－２毒素具有较高的检测特异性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种酶联免疫检测试剂盒及检测样品中T-2毒素的方法。
技术介绍
T-2毒素(T_2toxin)是单端孢霉烯族毒素(Trichothecenes)之一，T-2毒素是一 种倍半萜烯化合物，学名为4 β -1，5- 二乙酰氧基-8 α - (3-甲基丁酰氧基)-3 α -羧基-12， 13-环氧单端孢霉-9-烯，分子式为C24H34O9,分子量为466. 22。Τ-2毒素的毒性强烈，可由多种真菌产生。Τ-2毒素作为一种常见的真菌毒素，在 自然界中广泛存在，主要污染小麦、大麦、玉米等粮食作物及其制品，对人类健康及畜牧业 构成了较大危害。Τ-2毒素可引起机体过氧化损伤，还具有致畸性和弱致癌性。此外，Τ-2 毒素可能还与我国某些地区的大骨节病、食管癌和克山病的高发病率有关。目前检测Τ-2毒素的方法主要有薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法、放射免疫 法和质谱分析法等。上述方法各有优缺点，但主要存在的问题是对设备依赖性高，并且不能 够实现对大批量样品的快速检测，因此，限制了这些方法的应用。因此，开发一种不受检测设备的限制并且能够实现对大批量样品进行快速检测的 产品和方法成为迫切需要解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有的检测Τ-2毒素的方法存在的对设备的依赖性高，并 且不能够实现对大批量样品的快速检测的缺点，提供一种不受检测设备的限制并且能够实 现对大批量的Τ-2毒素样品进行快速检测的酶联免疫检测试剂盒。本专利技术的另一个目的是提供一种检测样品中Τ-2毒素的方法。为了实现本专利技术的第一个专利技术目的，本专利技术提供了一种酶联免疫检测试剂盒，其 中，该试剂盒包括(1)包被有Τ-2毒素抗原的酶标板；(2)酶标记物；(3) Τ-2毒素特异性抗体；(4) Τ-2毒素标准品溶液；(5)底物显色液；(6)终止液；(7)洗涤液；(8)复溶液；其中，所述Τ-2毒素抗原是通过将Τ-2毒素的C-3位衍生物与牛血清白蛋白进行 偶联得到的，所述Τ-2毒素特异性抗体为使用所述Τ-2毒素抗原获得的鼠源单克隆抗体。为了实现本专利技术的另一个目的，本专利技术还提供了一种检测样品中Τ-2毒素的方 法，该方法包括以下步骤(1)对样品进行处理用样品提取溶液对样品进行提取，然后用所述复溶液溶液 进行稀释，得到样品溶液；(2)用上述的本专利技术的试剂盒进行检测；(3)分析检测结果制作T-2毒素标准品的标准曲线图，从该标准曲线上读出样品 溶液中T-2毒素的浓度。本专利技术提供的试剂盒对检测设备的依赖性低，其中所使用的酶标板体积小、携带 方便、含有大量的孔，并且本专利技术的试剂盒中所使用的各溶液以工作液或浓缩液形式提供， 可以直接使用或简单稀释后使用，非常方便，同时使用本专利技术的试剂盒的检测结果准确度 高、可重复性高，检测方法简单易行，因此本专利技术的试剂盒能够实现对大批量的样品进行快 速检测。并且本专利技术的试剂盒中所使用的T-2毒素特异性抗体能够与T-2毒素发生特异性 的结合反应，同时与其它T-2毒素结构类似物的交叉反应率则很低，从而大大地提高了检 测的特异性和灵敏性。由此可见，本专利技术提供的试剂盒和检测方法具有不受检测设备的限制并且能够实 现对大批量的T-2毒素样品进行快速检测的优点，同时对T-2毒素具有较高的检测特异性。附图说明图1为实施例3中的T-2毒素标准品溶液的标准曲线图。具体实施方式本专利技术提供了一种酶联免疫检测试剂盒，该试剂盒包括(1)包被有T-2毒素抗原的酶标板；(2)酶标记物；(3) T-2毒素特异性抗体；(4) T-2毒素标准品溶液；(5)底物显色液；(6)终止液；(7)洗涤液；(8)复溶液；其中，所述T-2毒素抗原是通过将T-2毒素的C-3位衍生物与牛血清白蛋白进行 偶联得到的。对于制备小分子的抗体，人工抗原的合成是关键的一步，抗原的质量直接决定 着抗体的效价和特异性。T-2毒素是小分子吡啶化合物，分子量仅为466. 22，本身并不具备 免疫原性，为半抗原，同时，没有可供偶联的化学基团，必须进行分子改造，使其连接上带有 活性基团的有机分子，之后再与载体蛋白偶联才具有免疫原性。T-2毒素分子结构中用于连 接的位点对抗体的生成及其特异性起着决定性作用。通常情况下，离连接位点最远的部分 引起最强的抗体应答，即“免疫优势”。抗体的特异性是这些位点决定的。本专利技术将T-2毒素 的C-3位置作为引入带有活性基团的有机分子的位点，从而实现进一步与蛋白质的连接。 常用的带有活性基团的有机分子主要是琥珀酸酐(HS)、戊二酸酐(HG)或者甲基肟(CMO)， 本专利技术优选琥珀酸酐。所述将T-2毒素的C-3位衍生物与牛血清白蛋白进行偶联的方法包括(1)在蒸汽搅拌的条件下，使T-2毒素与琥珀酸酐、戊二酸酐或甲基肟在吡啶中反 应3-6小时；具体为，相对于10-15mg的T-2毒素，琥珀酸酐、戊二酸酐或甲基肟的用量为 150-300mg,吡啶的用量为 0. 4-0. 8mL ；(2)将步骤(1)所得的产物在氮气条件下旋转蒸干，用l_2mL氯仿、石油醚或二氯 甲烷重新溶解，以水洗涤3-6次，之后将产物旋转蒸干；(3)将步骤⑵的产物称取10_15mg，用N，N- 二甲基甲酰胺溶解、搅拌，之后加入 20-25mg牛血清白蛋白(BSA)，搅拌。之后称取15_20mg的碳二亚胺(EDPC)溶解于10_15mL 水中，逐滴加入上述溶液中。室温反应18-M小时，之后用0. 01-0. IM磷酸盐缓冲液透析 3-6天，得到T-2毒素抗原。在本专利技术的试剂盒中，所述T-2毒素特异性抗体为使用所述T-2毒素抗原获得的 鼠源单克隆抗体，该抗体的制备方法如下(1)动物免疫程序采用Balb/c小鼠作为免疫动物，免疫原(T_2毒素半抗原与牛 血清白蛋白的偶联物)每次的免疫剂量为30-100 μ g/只，优选40-60 μ g/只。首次免疫时 将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔2周取相同 剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，第6次免疫后腹腔加强免疫 一次，3天后取脾细胞；(2)细胞融合与克隆化取上述免疫后Balb/c小鼠的脾细胞，按5-12 1的比例 与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔，利用有限稀 释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；(3)细胞冻存和复苏取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成1-5 X IO6个 /mL的细胞悬液，分装于冻存管，可在液氮中长期保存，复苏时取出冻存管，立即放入37°C 水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养；(4)单克隆抗体的制备与纯化采用体内诱生法，将Balb/c小鼠(8周龄)腹腔注 入灭菌石蜡油0. 5-lmL/只，14天后腹腔注射杂交瘤细胞3-12X IO5个/只，10天后采集腹 水，用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，小瓶分装，-70°C保存；(5)可将腹水在35_40°C下烘干得到抗体冻干粉，放入_70°C保存；本专利技术的试剂盒中，所述包被有T-2毒素抗原的酶标板的制备方法包括(1)用包被缓冲液将T-2毒素抗原稀释成0. 05-0. 2 μ g/mL浓度的抗原稀释液；(2)向酶标板的各孔中加入100-150 μ L步骤⑴得到的抗原稀释液，35本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：（１）包被有Ｔ－２毒素抗原的酶标板；（２）酶标记物；（３）Ｔ－２毒素特异性抗体；（４）浓度已知的多个Ｔ－２毒素标准品溶液；（５）底物显色液；（６）终止液；（７）洗涤液；（８）复溶液；其中，所述Ｔ－２毒素抗原是通过将Ｔ－２毒素的Ｃ－３位衍生物与牛血清白蛋白进行偶联得到的，所述Ｔ－２毒素特异性抗体为使用所述Ｔ－２毒素抗原获得的鼠源单克隆抗体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王雄，王伟，葛宝坤，刘煊，陈冰君，果旗，王彦斐，戚大海，吴兆广，
申请(专利权)人：北京中检维康技术有限公司，天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心，
类型：发明
国别省市：11
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