本发明专利技术涉及一种新的治疗人体疾病的重组人血小板生成素（ｒｈＴＰＯ）昆虫杆状病毒基因治疗载体及ｒｈＴＰＯ昆虫杆状病毒，即在ｐＰＢａｃＭｔａｍ－２的ＥｃｏＲＩ位点中插入了全长９９９个碱基的ＴＰＯｃＤＮＡ，再与野生型杆状病毒ＤＮＡ共转染昆虫细胞，通过体内重组、噬斑筛选获得的重组病毒。它具有可在哺乳类动物细胞中高效表达ＴＰＯ的能力，及特异性促进血小板生成的能力，可用于治疗各种原因引起的血小板减少症和出血性疾病。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及一种新的治疗人体疾病的重组人血小板生成素(rhTPO)昆虫杆状病毒基因治疗载体及rhTPO昆虫杆状病毒。它可在昆虫细胞中扩增病毒，但不表达蛋白；而在哺乳类动物细胞中表达蛋白，病毒不会繁殖，具有特异性促进血小板生成的能力，可用于治疗各种原因引起的血小板减少症和出血性疾病。血小板生成素(TPO)是目前已知的唯一可促进血小板生成的细胞因子，1994年美国de.scnvasc最先分离出其基因，1996年即进入临床，足见人们对其重视的程度。众多动物体内、外实验表明，TPO单独作用可使巨核细胞体积增大，倍体数增加，血小板特异性膜蛋白表达增加，在正常和骨髓受抑的动物，TPO均可刺激血小板生成。临床实验结果表明，TPO可显著提高化疗前癌症患者的血小板数目。基因作为一种新的给药方式，已成为临床研究的一个热点。目前，临床基因治疗实验常用的载体为逆转录病毒及腺病毒载体，但由于逆转录病毒只能感染分裂期细胞，因而转染效率极低，且容纳外源基因的容量有限，还可使宿主细胞基因异常激活甚至有灭活的可能；腺病毒虽较之逆转录病毒的转染效率高一些，但其所携带或产生的病毒蛋白可诱发机体局部的炎性反应及全身性细胞免疫反应，其安全性，特别是远期的后果尚难以预料。因此，进一步发现新的基因治疗载体尤为重要。本专利技术的目的之一是开发一种用于治疗各种原因引起的血小板减少症的新的基因治疗载体以及具有生物活性的基因治疗载体工程药物，并提供一种可在哺乳动物细胞中高效表达出人TPO的昆虫杆状病毒，以及TPO的昆虫杆状病毒表达载体。本专利技术的目的之二是提供以重组DNA技术生产所说的TPO昆虫杆状病毒的方法。该方法包括在适于扩增本专利技术的基因治疗载体的条件下，含有编码所说的TPO之核酸序列的真核宿主细胞，然后从培养基中回收所说的病毒。本专利技术的目的之三是提供以重组DNA技术生成所说的TPO昆虫杆状病毒，并使其感染任何的哺乳动物细胞。本专利技术的目的之四是提供一种rhTPO昆虫杆状病毒基因载体的应用，使所获得的重组病毒(BM/TPO)可在昆虫细胞中大量扩增后直接导入动物体内治疗各种原因引起的血小板减少症和出血性疾病。上述目的通过以下技术方案来实现。附图说明图1重组BM/TPO昆虫病毒载体。图2长度为333个氨基酸的TPO氨基酸序列。图3PBacMam-2/TPO重组载体的构建及与杆状病毒DNA共转染sf9昆虫细胞。图4利用PT-PCR检测TPO在哺乳动物正常组织中的表达。图5BM/TPO病毒对哺乳动物血小板的生长促进活性。参见图3所示，重组质粒的构建及与杆状病毒DNA共转染sf9昆虫细胞等均按分子生物学常规方法进行。首先应用RT-PCR方法克隆出人全长TPOcDNA，再将人TPOcDNA通过基因重组技术，克隆进PBacMam-2表达载体中；再利用基因转染技术将重组的PBacMam-2/TPO载体与野生型杆状病毒DNA一起共转染昆虫细胞，经体内重组、噬斑筛选获得重组病毒。将阳性重组病毒在昆虫细胞中多次扩增后收取病毒颗粒导入哺乳动物细胞表达TPO。或直接将病毒颗粒注射入动物体内进行基因治疗。包含在载体内的适当的启动子、包括启动子和处于适当启动子控制下之多核苷酸编码序列的载体以及用于转染包装细胞系的多角体杆状病毒DNA都是基因治疗领域中已知的。本专利技术中所说的病毒最好是以纯化的方式存在，可通过常规的途径，如皮下，肌肉和腹腔注射等，将本专利技术的病毒颗粒投用于病人体内以表达TPO。可以用本专利技术的重组病毒颗粒体外感染任何的真核细胞，包括CHO，293，HeLa，Cos，HcpG2等及某些原代细胞。可以使用本专利技术全长基因的含有TPO基因的小片段作为cDNA文库的探针，这些探针一般至少有30个碱基，以检测TPO在正常阻止及外周血中的表达。本专利技术的优点体现在以下各方面1.高效本专利技术的重组病毒可感染多种哺乳动物细胞，且在哺乳动物细胞中可高效表达TPO；2.安全低毒与以往的基因治疗载体相比较，其昆虫杆状病毒最大的优点是，对哺乳动物细胞无毒副作用。重组病毒只在昆虫细胞中大量扩增而不表达蛋白，而在哺乳动物细胞中只表达重组目的蛋白。病毒不会在体内繁殖扩增。不表达病毒蛋白，因此也无致病性；3.生产工艺简单只需将重组病毒直接感染昆虫细胞，且易于体外大规模生产，回收的病毒纯化工艺简单，可直接应用；4.治疗易于控制可按临床需求追加注射次数。下面提供本专利技术的实施例。实施例1BM/TPO在小鼠体内mRNA表达的RT-PCR检测 称取注射TPO昆虫病毒后4、8、12、16天的肌肉组织为对照。使用TriZOLTM(GIBCO-BRI Co.)试剂抽提组织总DNA按每个反应管中加入Oligo(dT)16lug，总RNA5ug，SuperScript II 2U，10mmol/LNTP 2ul，0.1mol/DTT4ul，5xFirst Strand Buffer 8ul及DEPC水，总体积40ul，反应条件42℃，50min，70℃15min。PCR反应按常规方法进行，内参照β-actin上下游引物分别为5′-ATCATGTTTGAGACCTTCA-3′及5′-CATCTCTTGCTCGAAGTC-3′(2158-2475nt，318bp)；TPO上下游引物分别为5′-ACCCCTTTGCCTACACCTGTC-3′，5′-CAGAAGCCCAGAGCCAGTA-3′(161-657nt，495bp)。反应条件97℃预变性5min，然后94℃45s，58℃45s，72℃90s，共进行30个循环，结果显示TPO在病毒注射4天后组织中即有表达，且持续至第16天。实施例2BM/TPO病毒对哺乳动物血小板的生长促进活性随机挑选Balb/c小鼠分3组进行动物实验a对照组(NaCl组)注射0.9％生理盐水；b实验组(BM/TPO组)注射重组TPO病毒，剂量2.5×1010pfu/ml.Kg体重；c阳性对照组(TPO组)注射本室生产重组TPO因子，剂量为200ug/Kg体重。外周血小板计数按常规进行。上述动物实验结果显示实验组于注射后第4天外周血小板计数开始升高，升高幅度明显高于阳性对照组(p＜0.01)，第8天血小板计数达到峰值600×109/l，为对照组的2.35倍，且血小板计数持续升高，与阳性对照组相比均有显著性差异(p＜0.01或p＜0.05)，直至第28天恢复正常水平。本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基因治疗载体及基因治疗药物，其特征在于：该基因治疗载体是ＰＢａｃＭａｍ－２与ｒｈＴＰＯ的重组昆虫病毒载体，即在ｐＰＢａｃＭａｍ－２的ＥｃｏＲＩ位点中插入了全长９９９个碱基的ＴＰＯｃＤＮＡ；该基因治疗药物是ＢＭ／ＴＰＯ昆虫杆状病毒，即ＰＢａｃＭａｍ－２／ｒｈＴＰＯ的重组载体与野生型杆状病毒ＤＮＡ共转染昆虫细胞，经体内重组，再通过噬斑筛选获得的重组病毒。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种基因治疗载体及基因治疗药物，其特征在于该基因治疗载体是PBacMam-2与rhTPO的重组昆虫病毒载体，即在pPBacMam-2的EcoRI位点中插入了全长999个碱基的TPOcDNA；该基因治疗药物是BM/TPO昆虫杆状病毒，即PBacMam-2/rhTPO的重组载体与野生型杆状病毒DNA共转染昆虫细胞，经体内重组，再通过噬斑筛选获得的重组病毒。2.根据权利要求1所述的基因工程生产的药物，其特征在于利用昆虫细胞表达体系生产TPO杆状病毒。3.一种生产基因治疗载体工程药物的方法，其特征在于包括重组质粒的构建、共转染、噬...
【专利技术属性】
技术研发人员：侯纬敏，董东生，陆爱丽，
申请(专利权)人：董东生，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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