【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及利用1到600V/cm的弱电场向多细胞真核生物的细胞中体内转移核酸或与提高转移效率的物质结合之核酸的显著改善的方法，还涉及用于基因治疗应用的核酸与本专利技术转移方法的组合。基因向特定细胞中的转移是基因治疗的基础。然而，一个问题是向待处理的宿主细胞中引入足量的核酸；实际上该核酸(一般为目的基因)应在转染的细胞中表达。在此方面采用的一种方法是核酸在病毒载体中、尤其在反转录病毒、腺病毒或腺伴随病毒中的整合。这些系统利用病毒发展的细胞侵入机制，以及对抗降解的保护。然而，该方法也存在问题。特别是产生易于在宿主生物中传播的传染性病毒颗粒的危险，以及对于反转录病毒载体而言，插入诱变的危险。此外，治疗性基因或疫苗基因在病毒基因组中的插入能力仍然是有限的。在任何情况下，要发展可用于基因治疗的病毒载体必需借助于缺陷病毒及互补细胞系的复杂技术。另一种方法(Wolf等人，科学(Science)247，1465-68，1990；Davis等人，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)93，7213-18，1996)包括向肌肉或血流中施用一种质粒型核酸，...
【技术保护点】
一种向多细胞真核生物的细胞中体内转移核酸的方法，其中通过直接向组织施用或通过局部或全身施用使该组织细胞与待转移的核酸接触，并且通过对所述组织施加一次或多次强度为１－６００伏特／ｃｍ的电脉冲来确保转移。
【技术特征摘要】
FR 1997-6-30 97/08232;US 1997-12-1 60/067,4871.一种向多细胞真核生物的细胞中体内转移核酸的方法，其中通过直接向组织施用或通过局部或全身施用使该组织细胞与待转移的核酸接触，并且通过对所述组织施加一次或多次强度为1-600伏特/cm的电脉冲来确保转移。2.根据权利要求1的方法，其特征在于所述组织的细胞具有特别的几何形状(大尺寸和/或细长和/或对动作电位天然产生反应和/或具有特定的形态。3.根据权利要求1的方法，其特征在于电场强度为200-600伏特/cm。4.根据权利要求1的方法，其特征在于电场强度为约500伏特/cm。5.根据权利要求1-4任一项的方法，其特征在于施加电场的总持续时间长于10毫秒。6.根据权利要求1-5任一项的方法，其特征在于向组织施加的电场包括一个或多个规则频率的脉冲。7.根据权利要求6的方法，其特征在于向组织施加的电场包括0.1-1000赫兹频率的1-100000次脉冲。8.根据权利要求1-5任一项的方法，其特征在于这些电脉冲以彼此之间不规则的方式释放，而且描述依赖于脉冲时间的场强的函数是可变的。9.根据权利要求1-8任一项的方法，其特征在于描述电场随时间变化的函数的积分超过1kV·msec/cm。10.根据权利要求9的方法，其特征在于所述积分超过或等于5kV·msec/cm。11.根据权利要求1-10任一项的方法，其特征在于电脉冲选自方波脉冲，产生指数衰减波、短时振荡单极波和短时振荡双极波或其他波形的电场。12.根据权利要求1-11任一项的方法，其特征在于电脉冲包括方波脉冲。13.根据权利要求1-12任一项的方法，其特征在于电脉冲是利用置于组织两侧或与皮肤接触的电极来施加的。14.根据权利要求1-12任一项的方法，其特征在于电脉冲是利用引入待处理组织中的电极来施加的。15.根据权利要求1-14任一项的方法，其特征在于将核酸注射入组织中。16.根据权利要求1-14任一项的方法，其特征在于核酸通过系统途径注射。17.根据权利要求16的方法，其特征在于核酸通过动脉内或静脉内途径注射。18.根据权利要求1-14任一项的方法，其特征在于核酸通过局部、皮肤、口、阴道、鼻内、皮下、或眼内途径施用。19.根据权利要求1-18任一项的方法，其特征在于核酸存在于一种组合物中，后者还含有用于不同给药途径的药物可接受的赋形剂。20.根据权利要求19的组合物，它适于胃肠外给药。21.根据权利要求1-20任一项的方法，其特征在于核酸是脱氧核糖核酸。22.根据权利要求1-20任一项的方法，其特征在于核酸是核糖核酸。23.根据权利要求1-22任一项的方法，其特征在于核酸是合成或生物合成来源的，或者从病毒或原核生物或单细胞或多细胞真核生物中提取的。24.根据权利要求23的方法，其特征在于施用的核酸是与来源生物和/或合成系统全部或部分成分结合的。25.根据权利要求1-24任一项的方法，其特征在于核酸编码RNA或目的蛋白。26.根据权利要求25的方法，其特征在于RNA是催化的或反义的RNA。27.根据权利要求25的方法，其特征在于核酸编码选自下组的蛋白质酶，血衍生物，激素，淋巴因子，生长因子，营养因子，血管生成因子，神经营养因子，骨生长因子，造血因子，凝血因子，抗原和参与氨基酸、脂类和其他细胞必要成分之代谢的蛋白质。28.根据权利要求27的方法，其特征在于核酸编码血管生成因子VEGF和FGF，神经营养因子BDNF、CNTF、NGF、IGF、GMF、FGF1、NT3、NT5，Gax蛋白，治疗糖尿病的胰岛素，生长激素，细胞因子，α-1-抗胰蛋白酶，降钙素，瘦素和载脂蛋白，维生素、激素和神经递质合成中的酶。29.根据权利要求25的方法，其特征在于核酸编码抗体，单链抗体的可变片段(ScFv)或在免疫治疗中具有识别能力的其他抗体片段，或编码可溶性抗体、受体或粘着蛋白的激动或拮抗性肽、或人工的、嵌合的或截短的蛋白质。30.根据权利要求29的方法，其特征在于核酸编码抗独特型抗体，CD4受体或TNFα受体或乙酰胆碱受体的可溶性片段。31.根据权利要求27到30中任一项的方法，其特征在于核酸编码一种治疗性蛋白的前体。32.根据权利要求1到31中任一项的方法，其特征在于核酸为质粒形式。33.根据权利要求1到31中任一项的方法，其特征在于核酸含有大型基因和/或内含子和/或大或小的调节元件。34.根据权利要求1到31中任一项的方法，其特征在于核酸是附加体DNA或酵母的人工染色体或微型染色体。35.根据权利要求1到34中任一项的方法，其特征在于核酸含有允许和/或有利于转基因在组织中表达的序列。36.根据权利要求1到35中任一项的方法，其特征在于核酸与可以增强基因转移的任何类型的载体或这些载体的任意组合相连接，例如病毒、合成或生物合成的物质，或抛射或否的球。37.根据权利要求1到36中任一项的方法，其特征在于组织经过一种旨在改善基因转移的处理，一种经局部或系统施用的药理学性质的处理，或酶、透化、外科、机械、热或物理处理。38.根据权利要求1到37中任一项的方法，其特征在于可以使组织产生生理和/或治疗剂量的物质，产生在组织细胞中或被分泌出。39.根据权利要求1到38中任一项的方法，其特征在于可以通过调节被转染组织的体积来调节所表达的转基因量。40.根据权利要求39的方法，其特征在于可以通过利用多个施用位点来调节被转染组织的体积。41.根据权利要求1到40中任一项的方法，其特征在于可以通过调节电极的数量、形式、表面和排列，通过改变脉冲的强度、数量、持续时间、频率和形式，及核酸施用得量和体积来调节所表达的转基因量。42.根据权利要求1到41中任一项的方法，其特征在于可以通过经受局部电脉冲组织的体积来控制所转染组织的局部化。43.根据权利要...
【专利技术属性】
技术研发人员：M布瑞奥，L密尔，D舍曼，
申请(专利权)人：罗纳布朗克罗莱尔股份有限公司，古斯达威罗斯研究所，国家科研中心，
类型：发明
国别省市：FR[法国]
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