治疗肝癌的基因药物及其制备方法技术

本发明专利技术涉及治疗肝癌的基因药物及其制备方法。它是在已知的目的基因上通过多聚左旋赖氨酸（ＰＬ）与肝细胞导向分子ＡＳＯＲ连接。由于ＡＳＯＲ对肝细胞中乳糖蛋白分子存在特异性，实现靶向转染和靶向表达。为制备上述药物，首先将ＡＳＯＲ与ＰＬ在ＥＤＣ、ｐＨ７．２条件下反应，制成ＡＳＯＲ－ＰＬ复合物，然后再与目标基因充分混合，利用两者之间的静电引力结合在一起。本发明专利技术提供的基因药物对肝细胞具有特异性。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及治疗肝癌的药物，特别是基因药物，以及该药物的制备方法。目前，在基因治疗中，首先必须解决组织特异性治疗问题，即靶向转染和靶向表达。靶向转染是利用特异性载体将目的基因特异性地带到靶细胞。现有的方法有脂体包埋，局部导入，病毒衣壳蛋白的包装，利用受体分子制备的配体。这些方法中，首推制备配体分子，因为该靶向载体符合临床治疗模式。本专利技术的目的是提供具有特异性靶向载体的治疗肝癌的基因药物，同时提供该药物的制备方法。该基因药物是由去唾液酸类粘蛋白(ASOR)与多聚左旋赖氨酸(PL)的复合物和治疗基因以4-6∶1(重量)组成，其中的治疗基因是白介素2cDNA为0.91kb，γ-干扰素cDNA为1.1kb，将两者亚克隆于真核细胞表达载体PCDNA3.1(+)的质粒中。上述基因药物的制备方法是(1)将ASOR，PL和EDC混合溶解后，在PH7.4-7.2，37℃下搅拌反应，然后透析除盐，并分离出ASOR-PL复合物；(2)将上述得到的ASOR-PL复合物与治疗基因按4-6∶1(重量)充分混合后，过滤除菌。ASOR作为配体分子对肝细胞中的乳糖蛋白分子存在特异性。该去唾液酸类粘蛋白可由类粘蛋白OR，经酸解法脱去唾液酸后制成。本申请人还确定了ASOR-PL与DNA的配比关系为4-6∶1。当靶向载体过剩时，可竞争性地抑制目的基因进入肝脏；另一方面，当DNA过剩时，剩余的DNA失去靶向作用。将ASOR-PL和目的DNA分别接0∶1，1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，5∶1，6∶1，7∶1，8∶1，9∶1，10∶1(重量)11个不同的组合制备药物。然后在0.8％琼脂糖凝胶中进行阻滞电泳，电泳的条件为电压80V，时间1小时。电泳后在溴乙锭溶液中染色30分钟，紫外透射仪检测结果。结果如下比例小于4∶1的能检测出未阻滞的目的DNA；比例为4∶1的仅有痕量的未阻滞目的DNA，比例为5∶1时，全部目的DNA被阻滞。由此说明ASOR-PL与目的DNA的最佳比例为5∶1。实验表明，本专利技术提供的基因药物能使治疗基因定向富集在肝细胞上。实施例1.ASOR-PL复合物的制备首先将OR用酸解法制备ASOR，然后将ASOR，PL和EDC按1.0∶0.22∶0.45重量比混合溶解后，用NaOH调PH为7.2，在37℃下搅拌反应3小时后，在蒸馏水中透析48小时除盐，再用G50层析柱，在PH7.2-4的缓冲液，10mmolPBS进行层析分离，收集第1峰物质，进行超滤浓缩即得到ASOR-PL复合物。用Bradford法测定溶液中ASOR-PL含量。2.治疗基因的重组将含有IFN-r的PHIIF-SV-gamma和含有IL-2的PcDHT-5质粒转入JM-199大肠杆菌中扩增，回抽提质粒，用BamHI酶切上述质粒和真核细胞表达的载体质粒PcDNA3.1(+)，低溶点胶分离所切片段，以T4DNAligase在胶中连接后，转入感受态JM-199菌中，经用BamHI酶切筛出阳性克隆扩增，纯化阳性质粒，经用DNA序列分析，选出确为含有目的基因序列，并且插入方向正确的克隆再扩增回收质粒。目的基因片段IL-2CDNA为0.94kb，IFN-rcDNA为1.1kb。3.ASOSR-PL复合物与治疗基因的连接将ASOR-PL，DNA按5∶1(重量)混合，在37℃下维持1小时，经0.22μm滤膜过滤去菌即可。药代动力学研究(1)以该比例制备的药物经静脉注入SD大鼠体内后，用同位素P32-dATP标记质粒DNA片段，用Southern印迹的方法，发现其它组织中不存在靶向药物，说明该药物的靶向性好。(2)经尾静脉注入SD大鼠体内10-30分钟时为血药高峰期，1小时后在血中几乎测不到。10分钟后开始在肝脏出现，45分钟时出现高峰，并持续6小时在高峰水平；24，48，72小时均可检测到较高浓度的基因载体在肝细胞内，8天后仅有微量，10天后测不到载体质粒DNA。其它组织，除肾脏在30，45，60分钟可检测到载体质粒DNA外，其它组织均在注药1小时后未能测出载体质粒。本文档来自技高网...

【技术保护点】
治疗肝癌的基因药物，由去唾液酸类粘蛋白（ＡＳＯＲ）与多聚左旋赖氨酸（ＰＬ）的复合物和治疗基因以４－６∶１（重量）组成，其中的治疗基因是白介素２ｃＤＮＡ为０．９１ｋｂ，γ－干扰素ｃＤＮＡ为１．１ｋｂ，将两者亚克隆于真核细胞表达载体ＰＣＤＮＡ３．１（＋）的质粒中。

【技术特征摘要】
1.治疗肝癌的基因药物，由去唾液酸类粘蛋白(ASOR)与多聚左旋赖氨酸(PL)的复合物和治疗基因以4-6∶1(重量)组成，其中的治疗基因是白介素2cDNA为0.91kb，γ-干扰素cDNA为1.1kb，将两者亚克隆于真核细胞表达载体PCDNA3.1(+)的质粒中...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢放根，
申请(专利权)人：湖南投资生生基因药物开发有限公司，
类型：发明
国别省市：43[中国|湖南]