一种新型抗肿瘤血管生成多肽制造技术

本发明专利技术公开了一种新型抗肿瘤血管生成多肽，分子量为１６８３，氨基酸序列为ＡＴＷＬＰＰＲＡＡＮＬＬＭＡＡＳ。该Ｖ３肽由Ｖ１肽和Ｖ２肽通过柔性连接子Ａｌａ－Ａｌａ构建而成；Ｖ１肽的序列为ＡＴＷＬＰＰＲ；Ｖ２肽的序列为ＮＬＬＭＡＡＳ。本发明专利技术的优点在于首次将两条具有抗血管生成活性的多肽连接成新的多肽Ｖ３。Ｖ３肽能够显著抑制移植瘤的生长，随着浓度的提高，抑瘤效果逐渐增强，呈现出明显的剂量依赖性。且随着Ｖ３肽浓度的升高，裸鼠移植瘤中的微血管数目逐渐减少，表现出一定的剂量依赖性。在相同浓度下，Ｖ３肽能够表现出更强的抗肿瘤生长与抗肿瘤血管生成能力。同时，Ｖ３肽对裸鼠免疫系统及重要脏器无明显毒性，为进一步的临床研究与应用奠定坚实的基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及抗肿瘤药物的研究，尤其是涉及一种新型抗肿瘤血管生成多肽。
技术介绍
血管生成是在原有血管内皮细胞基础上形成新血管的自然过程。血管生成在肿 瘤生长和转移过程中起着非常重要的作用，不仅可以为肿瘤生长和转移提供必需的氧气和 营养物质，而且还可以带走所产生的代谢废物。许多与肿瘤血管生成相关的生长因子已经 被鉴定出来，包括碱性呈纤维生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子 (VEGF)、胎盘生长因子、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、以及血管生成素(Ang)等。目前肿瘤血 管生成相关因子的研究主要集中于VEGF家族和Ang家族。VEGF家族及其受体VEGFR在生理及病理性的血管与淋巴管的形成过程中起着非 常重要的作用。VEGF家族包括六个成员，即VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E和 PIGF。在肿瘤血管生成的过程中，VEGF-A是最重要的调节者。VEGF-A是一个同源二聚体蛋 白，能够被选择性地切割成为分别含有121、145、165、189和206个氨基酸残基的片段。研究 表明VEGF165在内皮细胞增殖、迁移和管状形成过程中起着关键作用，VEGF165产生的信号 优先通过酪氨酸激酶受体VEGFR-2 (KDR)进行转导，并且能够通过与内皮细胞膜上的NRP-I 相互作用形成包含VEGF165、KDR和NRP-I的三聚体复合物，从而使其信号转导作用显著增 强。血管内皮细胞上另一个重要的特异性酪氨酸激酶受体是Tie-2，其通过与配体 Ang-I和Ang-2结合来调节血管生成的功能。Ang-I是一个活性配体，它不仅能够诱导Tie_2 磷酸化，而且可以促进内皮细胞生存、迁移和血管稳定。Ang-2是Ang-I的天然拮抗剂，能够 抑制Tie-2的作用，从而导致血管去稳定。此外，研究表明同时抑制由VEGFR-2和Tie_2介 导的信号通路比单独抑制其中一条通路有更强的维持正常血管及肿瘤相关血管完整和稳 定的能力。因此，理想的抗血管生成疗法可能需要同时抑制VEGFR-2和Tie-2介导的信号 通路，从而能够显著抑制肿瘤的生长和转移。近年来，通过噬菌体展示文库技术已经鉴定出许多内源性多肽，这些多肽在血管 生成过程中起着重要的作用，其中包括两条七肽，即ATWLPra(Vl)和NLLMAAS(V2)。ATWLPI3R 通过与NRP-I特异性结合并选择性抑制VEGF 165与NRP-I结合来实现其体内外抗血管生 成活性，从而抑制肿瘤的生长和转移。而NLLMAAS则能够以剂量依赖的方式来抑制Ang-I 和Ang-2与Tie-2的结合并抑制Ang-I诱导的ERK活性，体内试验表明NLLMAAS能够抑制 鸡胚尿囊膜上的血管生成。因此，ATWLPPR、NLLMAAS及其它们的衍生物可能成为发展新型 抗肿瘤血管生成和治疗其他血管疾病的良好药物。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种能够显著抑制移植瘤生长和转移的新型抗肿瘤血管 生成多肽。为实现上述目的，本专利技术可采取下述技术方案本专利技术所述的新型抗肿瘤血管生成多肽，由17个氨基酸残基组成，分子量为 1683，氨基酸序列为Ala-Thr-Trp-Leu-Pro-Pro-Arg-Ala-Ala-Asn-Leu-Leu-Met-Ala-Ala-Sero所述多肽(V3肽)由Vl肽和V2肽通过柔性连接子Ala-Ala构建而成；所述Vl肽 的氨基酸序列为Ala-Thr-Trp-Leu-Pro-Pro-Arg，分子量为840 ；所述V2肽的氨基酸序列为 Asn-Leu-Leu-Met-Ala-Ala-Ser,分子量 为 717。本专利技术的优点在于首次将两条具有抗血管生成活性的多肽，即Vl肽(ATWLPPR) 和V2肽(NLLMAAS)通过柔性连接子Ala-Ala连接起来，从而构建一条新的多肽 V3 (ATffLPPRAANLLMAAS)。研究表明V3肽能够显著抑制S180和H22移植瘤的生长，并且随着 浓度的提高，抑瘤效果逐渐增强，呈现出明显的剂量依赖性。此外，随着V3肽浓度的升高， 裸鼠移植瘤中的微血管数目逐渐减少，亦表现出一定的剂量依赖性。在相同浓度下，与VI、 V2及V1+V2组相比，V3肽能够表现出更强的抗肿瘤生长与抗肿瘤血管生成能力。同时，V3 肽对裸鼠免疫系统及重要脏器无明显毒性，给药期间对裸鼠的体重增加没有明显影响。提 示V3肽能够成为一种有效的抗肿瘤候选药物，从而为进一步的临床研究与应用奠定坚实 的基础。附图说明图1、图2、图3分别是V1、V2、V3肽的质谱鉴定图。图4al、图4a2、图4bl、图4b2分别为裸鼠接种S180肉瘤与H22肝癌细胞前后对比图。图 5al、图 5a2、图 5bl、图 5b2、图 5cl、图 5c2 分别为 VI、V2、V1+V2、V3 肽对 BALB/ c裸鼠S180和H22移植瘤生长的影响示意图。图6al、图6a2为BALB/c裸鼠皮下给药VI、V2、V1+V2、V3肽7天的体重变化曲线图。图6bl、图6b2为各组裸鼠在试验开始和第七天的体重图。图7为显微镜下各组裸鼠肿瘤组织HE染色结果图。图8a为显微镜下各组移植瘤⑶34免疫组化染色结果图。图8bl、图8b2为各组移植瘤中的微血管密度图。具体实施例方式本专利技术所述的新型抗肿瘤血管生成多肽，该多肽由17个氨基酸残基组成，分子量 为1683，氨基酸序列为Ala-Thr-Trp-Leu-Pro-Pro-Arg-Ala-Ala-Asn-Leu-Leu-Met-Ala-Ala-Sero多肽(V3)由Vl肽和V2肽通过柔性连接子Ala-Ala构建而成；Vl肽的氨 基酸序列为Ala-Thr-Trp-Leu-Pro-Pro-Arg，分子量为840 ；V2肽的氨基酸序列为 Asn-Leu-Leu-Met-Ala-Ala-Ser，分子量为 717 ；见表 1。表1 VI、V2、V3肽序列及其分子量<table>table see original document page 5</column></row><table>实验方法和结果1、V1、V2、V3肽采用标准Fomc固相有机合成法进行合成。首先通过树脂与目的多 肽的第一位带保护基的氨基酸在一定条件下进行缩合，随后脱掉保护基，加入第二个氨基 酸进行缩合。重复以上步骤，直到加入最后一个氨基酸，脱掉其保护基后，利用切割试剂把 多肽从树脂上切下得到粗肽。经过脱盐处理，RP-HPLC分析纯化，其纯度大于95%，得到精 肽。ESI-MS质谱分析并证实其分子量符合理论值。V1、V2、V3肽的质谱鉴定结果分别见图 1、图2、图3。2、建立裸鼠移植瘤模型。S180肉瘤与H22肝癌细胞接种于昆明小鼠腹腔，5-7天后 无菌条件下抽取荷瘤小鼠乳白色腹水，0. 2 %台盼兰染色检测细胞成活率> 95 %。用PBS洗 涤3次后，常规培养于含10%胎牛血清和100IU/ml青霉素、100 μ g/ml链霉素的RPMI-1640 培养基中，置于37°C，5% CO2及饱和湿度的培养箱中进行培养，每2-3天更换新培养基。当 S180与H22细胞体外培养至对数生长期时，制成细胞悬本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种新型抗肿瘤血管生成多肽，其特征在于：该多肽由１７个氨基酸残基组成，分子量为１６８３，氨基酸序列为　　Ａｌａ－Ｔｈｒ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｓｎ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｍｅｔ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｓｅｒ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：祁元明，陈鲤翔，吴东栋，高艳锋，康巧珍，王海丽，翟明霞，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：41[中国|河南]