本发明专利技术公开了一种采用荧光定量ＰＣＲ技术检测常见致病菌的寡核苷酸引物及其检测常见致病菌的方法和用途，提供了１０对用于该方法中退火温度（５０～６０℃）不相差５℃的特异寡核苷酸引物序列，可同时对多种致病菌同时、快速、准确、高效地鉴定和定量检测。检测范围包括蜡样芽胞杆菌、阪崎肠杆菌、副溶血性弧菌、肠出血性大肠杆菌Ｏ１５７、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、志贺氏菌、空肠弯曲菌、铜绿假单胞杆菌和肺炎克雷伯氏杆菌等。本发明专利技术还可用于疾病诊断、环境监测、水质与食品的监督与检测、食物中毒病源菌检测、细菌学分类与流行病学调查、生物战剂检测等领域。方便快捷，准确，高效和应用范围广。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种致病菌检测
，特别是涉及一种方便快捷、准确、高效和应 用范围广的采用荧光定量PCR技术检测常见致病菌的寡核苷酸引物及其检测常见致病菌 的方法和用途。
技术介绍
众所周知，致病菌检测在疾病诊断、环境监测、食品中毒检测、进出口食品检疫、科 学研究等领域中有着重要的应用。传统的致病菌检验方法仍停留在分离培养、形态观察、生 化鉴定和血清学分型水平，不仅花费的时间长，而且无法对难以培养的病原菌进行有效检 测，且只能对有限的种类进行逐个的检测。随着科学技术的发展，一些新的技术可以实现 对致病菌的快速检测或定量检测或同时高通量检测，如常规PCR技术、定量PCR技术、多重 PCR、生物芯片技术等，它们均存在一定的不足。常规PCR可以实现对微生物尤其是致病菌的快速检测，但不能对待检的致病菌进 行定量，而且一次实验只能检测一种致病菌，效率低；定量PCR可以对待检致病菌进行定量 检测，但一次实验只能检测一种待检致病菌，不能实现对致病菌的高通量(同时)检测；多重 PCR和基因芯片虽然具备一次同时检测几种致病菌的能力，但这两种方法的最大不足就是 不能对待检致病菌进行定量，此外，多重PCR对引物的要求较高，且有电泳阶段，容易发生 交叉感染，引起假阳性的发生；基因芯片需要设计探针。
技术实现思路
本专利技术为解决公知技术中存在的技术问题而提供一种方便快捷、准确、高效和应 用范围广的采用荧光定量PCR技术检测常见致病菌的寡核苷酸引物及其检测常见致病菌 的方法和用途。本专利技术为解决公知技术中存在的技术问题，所采取的技术方案是一种采用荧光 定量PCR技术检测常见致病菌的寡核苷酸引物，包含以下各对引物的全部或部分引物的组 合蜡样芽胞杆菌 Bc-gyrB-1 5，-GCTTCACCATCTTGTTTGG-3， Bc-gyrB-2 5' -CGCCCATTATCCGTTACA-3‘ 阪崎肠杆菌 Es-ompA-1 5’ - GCTGAGCGTAGGTGTTTCCT-3’ Es-ompA-2 5’ -CAGGGTGAAGTGCTTGGTCT-3’ 副溶血性弧菌 Vp-tdh-1 5’ - AATGGTTGACATCCTACATGACTG-3， Vp-tdh-2 5’ - ACTTGACCTGATTTTACGAACACA -3’肠出血性大肠杆菌 0157 0157-eae-l 5’ - TTACCAGCGATACCAAGAGC -3， 0157-eae-2 5’ - CAACATGACCGATGACAAGG -3， 沙门氏菌Sal-fim-1 5，- TACCAACCGGCAAGGCATAA -3，4Sal-fim-2 5’ - GACACCGCCGTTTAAGAAATG -3，单核细胞增生李斯特氏菌 Lm-hly-1 5，- GGGAAATCTGTCTCAGGTGATGT -3， Lm-hly-2 5， -CGATGATTTGAACTTCATCTTTTGC-3， 志贺氏菌Sf-ipa-1 5，- CCGGGATAAAGTCAGAACTC -3，Sf-ipa-2 5’ - CTCCCGACACGCCATAGAAA -3’空肠弯曲菌 Cj-htp-1 5，- CTGAATTTGATACCTTAAGTGCAGC -3， Cj-htp-2 5’ - AGGCACGCCTAAACCTATAGCT -3， 铜绿假单胞杆菌 Pa-gyr-1 5，- CAAGCCCTACAAGAAATCCG -3， Pa-gyr-2 5’ - TCCACCGAACCGAAGTTG -3，肺炎克雷伯氏杆菌 Kp-pho-1 5，- TGCCCAGACCGATAACTTTA -3，Kp-pho-2 5， - CTGTTTCTTCGCTTCACGG -3， 所述引物长度为15-30bp，碱基成分中G+C含量40%-60%，避免形成稳定的寡核苷酸引 物二聚体和发夹结构，产物长度在100 200bp，所有寡核苷酸引物具有相似的Tm值。所述引物长度优选为18_25bp。所述的寡核苷酸引物用于检测常见致病菌的方法，包括以下步骤查询目标致病 菌的特异保守基因，以此为靶基因设计寡核苷酸引物，使其退火温度在50 60°C之间；对 检测样品进行处理，提取核酸模板；将模板分别加入装有不同特异寡核苷酸引物对的小管 中，再加入相应的荧光定量PCR试剂；在同一轮荧光定量PCR循环下，使各寡核苷酸引物在 各自的反应管中对样品进行同时、快速和定量检测。所述各菌的引物的退火温度差在0_5°C之间。所述荧光定量PCR条件为预变性94°C、20秒，变性94°C、5 秒，退火60°C、31秒，40个循环。所述的常见致病菌包括蜡样芽胞杆菌、阪崎肠杆菌、副溶血性弧菌、肠出血性大肠 杆菌0157、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、志贺氏菌、空肠弯曲菌、铜绿假单胞杆菌、 肺炎克雷伯氏杆菌、霍乱弧菌、小肠结肠耶尔森氏菌、创伤弧菌、肠球菌、变形杆菌、肉毒梭 状芽孢杆菌、血溶性链球菌或产气荚膜梭菌的一种或几种的组合。所述的检测样品源于血液、痰液的临床标本，水、食品、大气、土壤环境中的致病菌 组分。所述的寡核苷酸引物用于检测常见致病菌的方法，在提供临床疾病数据、环境监 测与评价、水质与食品的监督与检测、食物中毒病源菌检测、细菌学分类与流行病学调查、 生物战剂检测中的应用。本专利技术具有的优点和积极效果是采用特异寡核苷酸引物和荧光定量PCR技 术在同一 PCR循环中同时对多种致病菌进行鉴别和快速、定量检测，方便快捷，准确，高效 和应用范围广，可广泛用于临床疾病诊断、环境监测与评价、水质与食品的监督与检测、食 物中毒病源菌检测、细菌学分类与流行病学调查、生物战剂检测。具体实施例方式为能进一步了解本专利技术的
技术实现思路
、特点及功效，兹例举以下实施例，详细说明如 下本专利技术采用荧光定量PCR技术检测常见致病菌的寡核苷酸引物，包含以下各对引物的 全部或部分引物的组合蜡样芽胞杆菌 Bc-gyrB-1 5，-GCTTCACCATCTTGTTTGG-3， Bc-gyrB-2 5' -CGCCCATTATCCGTTACA-3‘ 阪崎肠杆菌 Es-ompA-1 5’ - GCTGAGCGTAGGTGTTTCCT-3’ Es-ompA-2 5’ -CAGGGTGAAGTGCTTGGTCT-3’ 副溶血性弧菌 Vp-tdh-1 5’ - AATGGTTGACATCCTACATGACTG-3， Vp-tdh-2 5’ - ACTTGACCTGATTTTACGAACACA -3’肠出血性大肠杆菌 0157 0157-eae-l 5’ - TTACCAGCGATACCAAGAGC -3， 0157-eae-2 5’ - CAACATGACCGATGACAAGG -3， 沙门氏菌Sal-fim-1 5，- TACCAACCGGCAAGGCATAA -3，Sal-fim-2 5’ - GACACCGCCGTTTAAGAAATG -3，单核细胞增生李斯特氏菌 Lm-hly-1 5，- GGGAAATCTGTCTCAGGTGATGT -3， Lm-hly-2 5， -CGATGATTTGAACTTCATCTTTTGC-3， 志贺氏菌Sf-ipa-1 5，-本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种采用荧光定量ＰＣＲ技术检测常见致病菌的寡核苷酸引物，其特征在于，包含以下各对引物的全部或部分引物的组合： 蜡样芽胞杆菌 Ｂｃ－ｇｙｒＢ－１ ５’－ＧＣＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＴＧＴＴＴＧＧ－３’ Ｂｃ－ｇｙｒＢ－２ ５’－ＣＧＣＣＣＡＴＴＡＴＣＣＧＴＴＡＣＡ－３’ 阪崎肠杆菌 Ｅｓ－ｏｍｐＡ－１ ５’－ ＧＣＴＧＡＧＣＧＴＡＧＧＴＧＴＴＴＣＣＴ－３’ Ｅｓ－ｏｍｐＡ－２ ５’－ＣＡＧＧＧＴＧＡＡＧＴＧＣＴＴＧＧＴＣＴ－３’ 副溶血性弧菌 Ｖｐ－ｔｄｈ－１ ５’－ ＡＡＴＧＧＴＴＧＡＣＡＴＣＣＴＡＣＡＴＧＡＣＴＧ－３’ Ｖｐ－ｔｄｈ－２ ５’－ ＡＣＴＴＧＡＣＣＴＧＡＴＴＴＴＡＣＧＡＡＣＡＣＡ －３’ 肠出血性大肠杆菌Ｏ１５７ ０１５７－ｅａｅ－１ ５’－ ＴＴＡＣＣＡＧＣＧＡＴＡＣＣＡＡＧＡＧＣ－３’ ０１５７－ｅａｅ－２ ５’－ ＣＡＡＣＡＴＧＡＣＣＧＡＴＧＡＣＡＡＧＧ －３’ 沙门氏菌 Ｓａｌ－ｆｉｍ－１ ５’－ ＴＡＣＣＡＡＣＣＧＧＣＡＡＧＧＣＡＴＡＡ －３’ Ｓａｌ－ｆｉｍ－２ ５’－ ＧＡＣＡＣＣＧＣＣＧＴＴＴＡＡＧＡＡＡＴＧ －３’ 单核细胞增生李斯特氏菌Ｌｍ－ｈｌｙ－１ ５’－ ＧＧＧＡＡＡＴＣＴＧＴＣＴＣＡＧＧＴＧＡＴＧＴ －３’ Ｌｍ－ｈｌｙ－２ ５’－ＣＧＡＴＧＡＴＴＴＧＡＡＣＴＴＣＡＴＣＴＴＴＴＧＣ－３’ 志贺氏菌 Ｓｆ－ｉｐａ－１５’－ ＣＣＧＧＧＡＴＡＡＡＧＴＣＡＧＡＡＣＴＣ －３’ Ｓｆ－ｉｐａ－２ ５’－ ＣＴＣＣＣＧＡＣＡＣＧＣＣＡＴＡＧＡＡＡ －３’ 空肠弯曲菌 Ｃｊ－ｈｔｐ－１ ５’－ ＣＴＧＡＡＴＴＴＧＡＴＡＣＣＴＴＡＡＧＴＧＣＡＧＣ －３’Ｃｊ－ｈｔｐ－２ ５’－ ＡＧＧＣＡＣＧＣＣＴＡＡＡＣＣＴＡＴＡＧＣＴ －３’ 铜绿假单胞杆菌 Ｐａ－ｇｙｒ－１ ５’－ ＣＡＡＧＣＣＣＴＡＣＡＡＧＡＡＡＴＣＣＧ －３’ Ｐａ－ｇｙｒ－２ ５’－ ＴＣＣＡＣＣＧＡＡＣＣＧＡＡＧＴＴＧ－３’ 肺炎克雷伯氏杆菌 Ｋｐ－ｐｈｏ－１ ５’－ ＴＧＣＣＣＡＧＡＣＣＧＡＴＡＡＣＴＴＴＡ －３’ Ｋｐ－ｐｈｏ－２ ５’－ ＣＴＧＴＴＴＣＴＴＣＧＣＴＴＣＡＣＧＧ －３’。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李君文，孙飞龙，金敏，邱志刚，谌志强，陈照立，王新为，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]
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