一种肿瘤导向治疗中的能特异性结合肝癌组织／细胞的粘附肽以及该粘附肽的应用，属于分子药理学技术领域。本发明专利技术提供的两种肝癌组织／细胞的粘附肽的多肽序列为：序列一：ＮＨ↓［２］－Ｔ－Ａ－Ｃ－Ｈ－Ｑ－Ｈ－Ｖ－Ｒ－Ｍ－Ｖ－Ｒ－Ｐ－ＣＯＯＨ和序列二：ＮＨ↓［２］－Ｓ－Ｐ－Ａ－Ｐ－Ｅ－Ｋ－Ｌ－Ｓ－Ｓ－Ｐ－Ｆ－Ｒ－ＣＯＯＨ，该肝癌组织／细胞特异性粘附肽导向效果好，组织分布特异性强，在制备肝癌的导向药物中具有广阔的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种肿瘤导向治疗中的导向肽以及该导向肽的应用，尤其是涉及一种能特异性结合肝癌组织/细胞的粘附肽以及该粘附肽的应用，属于分子药理学
技术介绍
肝癌作为一种最常见的恶性肿瘤对人类健康造成了极大的威胁，据估计，全世界每年死于肝癌的患者达1 25万。目前用于肝癌治疗的方法主要有手术疗法、放射线疗法和化学疗法等，但这些方法对人体的健康组织和器官都存在不同程度副作用。导向治疗技术为肿瘤的治疗开辟了广阔的前景。肿瘤导向治疗是指应用针对肿瘤特异性或相关抗原的单克隆抗体与杀伤肿瘤细胞的活性物质如化疗药物、毒素、放射性核素等相偶联，将活性物质选择性地运送到肿瘤部位，定向杀伤肿瘤细胞的方法。肿瘤导向治疗作为近年来兴起的第四种肿瘤疗法即生物治疗法中的重要组成部分而受到了人们很大的重视。关于利用噬菌体肽库技术对肿瘤组织特异性粘附肽的筛选，1996年Pasqualinii和Ruoslahti首先在Nature上报道了该方法，并且利用该方法筛选出了特异结合脑和肾的噬菌体结合肽。1997年他们成功筛选到一条对恶性黑素瘤和乳腺癌组织上的αV整合素特异性亲和的包含RGD的短肽，其与肿瘤细胞结合的特异性较与脑和肾正常组织结合高20倍以上；到目前为止，人们已发现多条特异性亲和人肿瘤血管的短肽，如RGD_4C，CNGRC，GSL，SMSIARL，CPGPEGAGC等，前述的两条短肽已在动物身上进行了抗肿瘤活性测定，抗癌效果良好。在导向治疗中非常关键的在于如何筛选得到具有很强特异性的导向肽，目前噬菌体肽库技术是一种比较有效的筛选方法。噬菌体肽库技术自20世纪90年代诞生以来给探索生物大分子间相互作用的结合位点、寻找高亲和力生物活性的配体分子以及给药物筛选、新型诊断试剂和疫苗等领域的研究带来了革命，其最大优点就是无需知道蛋白质的任何性质，就可筛选到特异性的结合肽，因而方法方便快速有效。目前用噬菌体肽库技术筛选导向肽分为体内筛选和体外筛选两种。体内筛选法尤其在筛选组织或肿瘤组织特异性结合肽时有其明显的优越性其一，噬菌体肽库进入机体的血液系统，在血液循环过程中可以去除大量与靶组织无关的噬菌体肽，经过多次重复操作后可以得到所需的组织或肿瘤特异性结合肽，其原理是不同的组织都有其特异细胞膜标志，如淋巴细胞的归巢、肿瘤细胞定向转移等；其二，在体内筛选到的是自然状态下的组织或肿瘤特异性结合肽，这在诊断和导向治疗中更有使用价值；其三，用体内筛选法经常能筛选到与肿瘤新生血管特异性结合的多肽，而肿瘤新生血管壁上存在着正常血管所没有或很少有的粘附分子，这些分子与肿瘤抗原相比其异质性和调变要少得多，也无需克服肿瘤的生物屏障，因此作为导向治疗的“弹头”有更多的优越性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种能特异性结合肝癌组织/细胞粘附肽；本专利技术的另一目的在于提供该肝癌组织/细胞粘附肽的用途。本专利技术提供的肝癌组织/细胞粘附肽，其多肽序列为序列一NH2-T-A-C-H-Q-H-V-R-M-V-R-P-COOH序列二NH2-S-P-A-P-E-K-L-S-S-P-F-R-COOH为得到上述肝癌组织/细胞粘附肽，本专利技术采取体外筛选方法。首先，用人肝癌细胞BEL-7402对噬菌体随机肽文库进行筛选，将得到的噬菌体肽扩增并纯化后，用人正常肝细胞L-02进行反向吸收，以去除非特异性的噬菌体肽，回收不与人肝脏细胞L-02结合的噬菌体并扩增完成一轮筛选。如此反复3轮，使噬菌体库中对肝癌细胞亲和力高而对正常肝细胞亲和力小的克隆得到富集。将第3轮得到的噬菌体单克隆化，随机挑取100个单克隆用细胞ELISA的方法进行鉴定。结果显示多数单克隆对人肝癌细胞BEL-7402有较高亲和力。选取亲和力高的阳性克隆用竞争ELISA、免疫荧光、流式细胞等方法来验证，通过荧光显微镜可以直接观察到阳性克隆与人肝癌细胞BEL-7402的结合。同时再将得到的阳性噬菌体克隆输到荷瘤裸鼠体内，通过不同组织的切片、免疫组化来确定其组织分布特异性，发现肿瘤组织吸附了较多噬菌体，验证了其导向效果，挑选阳性克隆，提取噬菌体DNA，测序，并分析测序结果。本专利技术还提供序列一NH2-T-A-C-H-Q-H-V-R-M-V-R-P-COOH和序列二NH2-S-P-A-P-E-K-L-S-S-P-F-R-COOH的肝癌组织/细胞特异性粘附肽在制备肝癌的导向药物中的应用。本专利技术提供的肝癌组织/细胞粘附肽导向效果好，组织分布特异性强，是一个很好的肝癌导向治疗中的粘附肽，具有较广阔的应用前景。具体实施例方式在说明具体实施方式前，先对本专利技术要用到的材料和试剂以及试剂的配置进行简单的说明 试验材料与试剂(一)试剂1.噬菌体展示随机12-肽文库，环状7肽库，购自美国New England Biolab公司2.人肝脏细胞L-02购自中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库3.人肝癌细胞BEL-7402购自中国科学院上海药物研究所4.兔抗噬菌体M13抗血清、辣根过氧化物酶标记的抗M13单克隆抗体购自瑞典Pharmacia公司。5.辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(HRP-羊抗兔IgG)、碘化丙锭(PI)、邻苯二胺(OPD)、二氨基联苯胺(DAB)等购自美国SIGMA公司6.硝酸纤维薄膜(NC膜)(美国进口分装)7.酵母提取物Yeast Extract、蛋白胨Proteous Peptone购自英国OXOID公司8.RPMI-1640干粉剂、新生小牛血清购自美国GIBCO公司9.二甲基亚砜购自德国SERVA公司10.胰蛋白酶由Difco进口分装11.异硫氰酸荧光黄(FITC标记的山羊抗兔IgG)购自华美公司12.IPTG(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，X-gal购自华美公司)(二)试剂的配制培养基1.大肠杆菌ER2738的LB培养基(1)LB液体培养基蛋白胨(Bacto-Tyrptone)10g/L；酵母粉(Yeast Extract)5g/L；NaCl 5g/L。加入适量的dH2O充分溶解后，用1N的NaOH将pH值调到7.0-7.5之间，最后用dH2O定容至1L，分装后高压灭菌。(2)LB固体培养基上述分装好的液体培养基加入1.5％的琼脂糖后再进行高压灭菌即可。(3)LB选择培养基将高压灭菌后的LB固体培养基加热完全溶解，待到冷却至50℃左右时加入四环素、IPTG、X-gal，小心摇动三角烧瓶充分混匀，注意掌握时间在培养基凝固之前浇制平板。抗生素的配制四环素储备液的配制四环素(tetracycline)1000×用50％乙醇溶解20mg/ml，-20℃避光保存。(4)软琼脂蛋白胨(Bacto-Tyrptone)10g/L酵母粉(Yeast Extract) 5g/L NaCl 5g/LMgCl·6H2O 1g/L琼脂 7g/L2.细胞培养基(1)RPMI1640培养基基本培养基800ml的三蒸水中加入RPMI-1640干粉剂溶解，加入2gNaHCO3，溶解后定容至1000ml。5％NaHCO3调节pH至7.0，0.22um过滤除菌，-20℃保存。完全培养基基本培养基90％56℃灭活30min的新生小牛血清 10％双抗 100单位/ml(2)D-hank’s母本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种肝癌组织特异性粘附肽，其特征在于多肽序列为： 序列一：ＮＨ↓［２］－Ｔ－Ａ－Ｃ－Ｈ－Ｑ－Ｈ－Ｖ－Ｒ－Ｍ－Ｖ－Ｒ－Ｐ－ＣＯＯＨ 序列二：ＮＨ↓［２］－Ｓ－Ｐ－Ａ－Ｐ－Ｅ－Ｋ－Ｌ－Ｓ－Ｓ－Ｐ－Ｆ－Ｒ－ＣＯＯＨ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：钱旻，周忠良，章平，杜冰，王鹏，郁萌，
申请(专利权)人：华东师范大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。