【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于荧光成像及生物传感，涉及一种检测ne(去甲基肾上腺素)的荧光探针及其制备方法，以及其在细胞成像与生物传感中的应用。
技术介绍
1、了解中枢神经系统(cns)中的神经递质如何影响神经内分泌系统、情绪调节的神经回路和认知之间复杂的相互作用，是现代神经科学的一个重大挑战。去甲肾上腺素(ne)是人类大脑中枢神经系统的主要儿茶酚胺神经递质之一，在新陈代谢、稳态平衡、情感障碍的病理生理学和其他生理功能中发挥着重要作用。其功能障碍也与神经退行性疾病和精神疾病密切相关，如帕金森病(pd)、阿尔茨海默病(ad)、癫痫、抑郁症和精神分裂症。因此，监测脑ne的变化对于了解和研究其在脑部疾病发展中的作用机制，以及进一步预防、诊断和治疗脑部疾病具有重要意义。
2、在各种分析方法中，荧光探针因其高灵敏度、超强的时空分辨率、操作简单、实时检测以及非侵入性，已成为生物分子监测和细胞内成像的最有希望的技术。到目前为止，设计用于快速、特异和敏感的ne检测的荧光探针仍然是一项具有挑战性的任务。首先，ne的结构和反应性与其他两种神经递质，肾上腺素(ep)和多巴胺(da)非常相似。其次，ne在神经系统中的释放和再摄取，其发生的时间尺度为毫秒至秒，所涉及的浓度相对较低(纳摩尔浓度)。最重要的是，大脑结构和神经系统的复杂性使得我们很难在分子水平和细胞内及深层脑区的实时动态中解开ne水平异常与精神疾病之间的联系。因此，非常迫切需要建立一种新的途径来实时监测活体大脑中ne传递的复杂通讯信号，这种测量技术能够无创、高空间和时间分辨率、高灵敏度、高化学特异
技术实现思路
1、本专利技术创新提供了一种ne荧光探针及其制备方法，以及其在细胞成像与生物传感中的应用。本专利技术提供的新型ne荧光探针(包括但不限于式2a-5a和式2b-5b所示的结构)具有选择性好、响应速度快、高稳定性等优点。本专利技术所述ne荧光探针是指检测ne(去甲基肾上腺素)的近红外荧光探针。
2、本专利技术提供了一系列的ne荧光探针(包括但不限于式2a-5a和式2b-5b所示的结构)，其结构如下式所示：
3、
4、其中，所述ne荧光探针3a-5a和2b-5b，随ne浓度升高探针的荧光发射峰逐渐升高，而探针2a为比率型探针，随ne浓度升高探针的荧光发射峰逐渐升高，在另外一个波长的发射峰保持不变，通过两个发射峰的比值变化可以对ne进行定量分析等，与其他探针相比，本专利技术所述ne近红外荧光探针选择性好，生物相容性好，响应速度快、高的稳定性，并且其中探针2a具备定量分析能力，使检测更准确，在生物传感、成像等方面具有很大优势。
5、本专利技术还提供了所述ne荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
6、将含有取代基的苯硫醇和吡啶、三光气进行第一反应得到液体，然后加入有机溶剂分别和化合物1a、1b进行第二反应，得到ne荧光探针。所述含有取代基的苯硫醇，包括但不限于对甲氧基苯硫醇、对叔丁基苯硫醇、对氟苯硫醇和对甲基苯硫醇。本专利技术制备得到的所述ne荧光探针包括但不限于如式2a-5a和式2b-5b所示的结构。
7、所述制备方法的反应过程如下反应式(a)所示：
8、其中，所述第一反应的温度为-30℃～10℃；优选地，为0℃。
9、其中，所述第一反应的时间为30min-120min；优选地，为60min。
10、其中，所述第一反应优选地在氮气氛围下进行。
11、优选地，所述第一反应结束后，冷却至室温后进行萃取后加入化合物1a或1b进行过夜反应(第二反应)。
12、其中，所述第二反应的温度为0℃-35℃；优选地，为35℃。
13、本专利技术中，所述第一反应是指含有取代基的苯硫醇和吡啶、三光气进行反应；所述第二反应是指第一反应得到的产物和化合物1a、1b反应。
14、其中，所述有机溶剂选二氯甲烷、乙腈或n,n-二甲基甲酰胺dmf等中的一种或多种；优选地，为n,n-二甲基甲酰胺dmf。
15、
16、其中，所述第二反应的时间为5h-24h；优选地，为10h。
17、其中，含有取代基的苯硫醇、吡啶、三光气、化合物1a或1b的摩尔比为5-100：5-100：5-100：1。优选地，为50：50：25：1。
18、在本专利技术的一个具体实施方式中，所述ne荧光探针的制备方法包括：
19、将含有取代基的苯硫醇(包括但不限于对甲氧基苯硫醇、对叔丁基苯硫醇、对氟苯硫醇或对甲基苯硫醇)(1mmol)、吡啶(1mmol)和三光气(0.5mmol)与无水二氯甲烷(1ml)的混合物在氮气保护条件下和0℃中搅拌1h。然后倒入100ml冰水中，将有机层分离，用水洗涤，用硫酸钠干燥，减压浓缩，粗产物直接用于进一步合成。将化合物1a或1b(0.1mmol)和三乙胺(0.2mmol)溶解在3mldmf中，加入上述粗产物，室温和氮气保护条件下搅拌10h。减压蒸发除去溶剂，粗产物经硅胶柱层析纯化，得到化合物2a-5a或2b-5b。
20、本专利技术还提供了一种如上所述方法制备得到的ne荧光探针2a-5a和2b-5b。
21、其中，所述ne荧光探针3a-5a和2b-5b，随ne浓度升高探针的荧光发射峰逐渐升高(图1)，而探针2a为比率型探针，随ne浓度升高探针的荧光发射峰逐渐升高，在另外一个波长的发射峰保持不变，通过两个发射峰的比值变化可以对ne进行定量分析等，与其他探针相比，本专利技术所述ne近红外荧光探针选择性好，生物相容性好，响应速度快、高的稳定性，并且其中探针2a具备定量分析能力，使检测更准确，在生物传感、成像等方面具有很大优势。
22、本专利技术还提供了所述ne荧光探针在体外和/或细胞内和/或活体内检测ne中的应用；通过单光子荧光检测、实现对ne的检测；其中，所述细胞包括但不限于神经元细胞等；所述活体不包括人。
23、本专利技术还提供了所述ne荧光探针在细胞成像与生物传感中的应用。
24、由于ne荧光探针可以与ne反应形成一种新的荧光物质，导致探针荧光的恢复。因此，本专利技术还提供了一种体外ne的荧光检测方法，所述方法包括以下步骤：在缓冲液中，将本专利技术所述ne荧光探针与ne混合摇匀进行反应，在激发波长650nm测定探针和新物质的荧光强度变化，从而实现对ne的定量检测。
25、其中，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液，优选地，所述磷酸盐缓冲液的浓度为10mm，ph为7.4。
26、其中，所述反应的温度为室温。
27、其中，所述反应的时间为60-105ms；优选地，为105ms。
28、其中，所述方法的线性范围为15nm-60μm；最低检测限为3.2nm。
29、其中，单光子荧光强度比与ne浓度的线性关系为r2＝0.983。
30、其中，所述方法可应用于细胞、活体中。
31、在本专利技术的一个具体实施方式中，所本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种NE荧光探针，其特征在于，其结构如下式2a-5a和2b-5b所示：
2.一种NE荧光探针的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第一反应的温度为-30℃～10℃；
4.将如权利要求1所述的NE荧光探针在体外和/或细胞内检测NE中的应用、在细胞成像与生物传感中的应用。
5.一种体外NE的荧光检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：缓冲液混合溶液中，将如权利要求1所述的NE荧光探针与NE进行反应，然后用激发波长为650nm的波长激发，测定溶液的荧光强度。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，随着加入NE含量的增加，所述NE荧光探针本身的荧光强度逐渐增加，其中探针2a的一个的发射峰的荧光强度几乎不变，另一个发射峰荧光强度逐渐增加，呈比率型变化，有良好的线性，从而实现对NE的定量检测。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液；和/或，所述反应的温度为室温；和/或，所述反应的时间为60ms-105ms。
8.一
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述孵育的温度为37℃；和/或，所述细胞与NE探针孵育的时间为10min-60min。
10.如权利要求1所述的NE荧光探针，其特征在于，其结构如下式2a-5a、式2b-5b所示：
...【技术特征摘要】
1.一种ne荧光探针，其特征在于，其结构如下式2a-5a和2b-5b所示：
2.一种ne荧光探针的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第一反应的温度为-30℃～10℃；
4.将如权利要求1所述的ne荧光探针在体外和/或细胞内检测ne中的应用、在细胞成像与生物传感中的应用。
5.一种体外ne的荧光检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：缓冲液混合溶液中，将如权利要求1所述的ne荧光探针与ne进行反应，然后用激发波长为650nm的波长激发，测定溶液的荧光强度。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，随着加入ne含量的增加，所述ne荧光探针本身的荧光强度逐渐增加，其中探针2a的一个的发射峰的荧光强度几乎不变，另一个发射峰荧光强度逐渐增加，呈...
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