本发明专利技术公开一种基于环介导等温扩增技术的甲型肝炎病毒基因快速诊断试剂盒及其检测方法，该试剂盒由两对引物、Ｂｓｔ ＤＮＡ聚合酶、逆转录酶、ＲＮＡ酶抑制剂、稳定液、反应液、显色液和阳性对照液组成，所述两对引物的核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～４所示，以上八种液体分别置于容器中。本发明专利技术的试剂盒及其检测方法可高效高特异性地检测甲型肝炎病毒，它们是基于环介导等温扩增技术，应用六个区段，四条引物，一个恒定温度，在不到１小时即可完成扩增反应，检测成本低、耗时短、产率高，特异性高，且阴阳性结果显色差异显著，验证率高，更加明显可靠。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物检测试剂，具体涉及一种基于环介导等温扩增技术的甲 型肝炎病毒基因快速诊断试剂盒及其检测方法。
技术介绍
目前对甲型肝炎病毒有多种检测方法，从以病原微生物分离鉴定、形态学鉴定和血清学鉴定为主的国家标准(GB/T 18936—2003)，到特异蛋白的免疫 学检测技术、核酸探针、聚合酶链式反应(PCR)技术等分子生物学检测方法(GB/T 22287-2008)。其中病原核酸检测在快速性、安全性、准确性和灵敏 性等方面都有很大的提高，这些新技术试图突破传统的形态学、生化反应等微 生物学检测旧模式，不需要对微生物进行分离提纯，而直接用样品或样品的增 菌液对其基因及基因产物进行快速检测，并且与分子生物学技术及生物信息学 手段相结合，向准确、快速、灵敏和自动化的方向发展。以聚合酶链式反应(PCR)技术为代表的病原核酸检测技术在实际应用中 也存在一些问题，如普通聚合酶链式反应(PCR)技术需要专门的仪器，而且 存在容易交叉污染和操作过程烦琐的缺点。而荧光实时定量聚合酶链式反应(real time PCR)技术虽然较好地解决了交叉污染的问题，并简化了操作过程， 但却需要更复杂的定量测定仪器，因此不适用于现场快速检测。而且实时定量 聚合酶链式反应PCR技术中荧光探针的成本较高，加大了推广应用的难度。免 疫学检测技术快速简便成本低廉，但要求高质量高稳定性的单克隆抗体，否则 因准确性不够，目前只能是辅助检测手段。所以及时运用生物技术发展的最新成果对满足病原微生物检测要求的不断提高具有重要意义。其中等温扩增(Isothermal Amplification)核酸快速检测技术是病原核酸检测技术上的长足 进步，现已建立起来的环介导等温扩增技术(LAMP)具有很多的优越性，且 目前也未见有用环介导等温扩增技术检测结核分歧杆菌的基因快速诊断试剂
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的不足，提供一种检测成本低、使用方便、 检测快速高效、灵敏度高的基于环介导等温扩增技术的甲型肝炎病毒基因快 速诊断试剂盒，该试剂盒是基于环介导等温扩增技术来检测甲型肝炎病毒的。本专利技术的另一个目的是提供上述甲型肝炎病毒基因快速诊断试剂盒的检 测方法。本专利技术的上述目的是通过如下技术方案予以实现的一、本专利技术的甲型肝炎病毒基因快速诊断试剂盒，是由两对引物、&fDNA 聚合酶、逆转录酶、RNA酶抑制剂、稳定液、反应液、显色液和阳性对照液 组成，以上八种液体分别置于容器中，其中所述两对引物为外引物F3，其核苷酸序列如SEQIDNO:l所示； 外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示； 内引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示； 内引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示； 其中，Y代表C或T;上述反应液含有1.6 2mmol/L dNTP、 20 25mmol/L Tris-HCl、 10 12.5mmol/L氯化钾、10 12.5mmol/L硫酸铵、8 10mmol/L硫酸镁、0.1 0.125 %TritonX-100、 0.8 lmol/L甜菜碱、内引物FIP/BIP各1.6 2mol/L和外引物 F3/B3各0.2 0.25mol/L。优选的比例是反应液含有2mmol/L dNTP、 25mmol/L TriS"Cl、 12.5mmol/L氯化钾、12.5mmol/L硫酸铵、10mmol/L硫酸镁、0.125% TritonX-100、 lmol/L甜菜碱、内引物FIP/BIP各2mol/L和外引物F3/B3各 0.25mol/L。 (0.1 0.125^TritonX-100是Triton X-100占反应液的体积百分比 为0.1 0.125%)上述逆转录酶优选为AMV逆转录酶。上述阳性对照为携带甲型肝炎病毒基因的质粒DNA。上述显色液优选为SYBR Green I或EvaGreen。上述稳定液优选为石蜡油。二、 本专利技术基因快速诊断试剂盒的生产工艺1、 将内引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成纯化后，定量配制，浓度检 测，抽样质检；2、 将反应液无菌分装，并按照实验用进行浓度确定，抽样质检；3、 将稳定液无菌分装，抽样质检；4、 将逆转录酶无菌分装，抽样质检；5、 将RNA酶抑制剂无菌分装，抽样质检；6、 将阳性对照标本制备，分装，抽样质检；7、 组装试剂盒。三、 本专利技术基因快速诊断试剂盒的检测方法 1、样品处理样品的采集、保存和处理，可采用GB/T 18936_2003中2.1款进行； 提取样品核酸，可采用GB/T 19439-2004进行样品核酸提取获得样品模 板或使用等同的商品化核酸提取试剂盒按说明书操作提取RNA模板。2、 环介导等温扩增技术反应过程在反应管中加入反应液38 40体积％ 、 Bst DNA聚合酶0.9 1.8体积％ 、 逆转录酶0.9 1.8体积％、 RNA酶抑制剂0.9 1.8体积％、稳定液52 54.5 体积％、样品模板RNA4.5 7.3体积X， 63 65。C恒温反应45 90min。所 述体积百分比是指占六个组分总体积的体积百分比。3、 反应后处理在上述反应管和阳性对照组中分别加入显色液，混匀，样品组显色与对 照组相同则为阳性，否则为阴性。本专利技术所说的基于环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal ampli cation of DNA,简称LAMP)快速检测甲型肝炎病毒的方法，是利用D NA聚合酶和根据耙基因序列设计的两对特殊的内、外引物(即内引物FIP/ BIP和外引物F3/B3)，特异性识别靶序列上的六个独立区域，启动循环链置 换反应，在靶标DNA区启动互补链合成，结果在同一链上互补序列周而复 始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物。LAMP反应过程中，从 dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg^结合，产生副产物——焦磷 酸镁乳白色沉淀，即可通过肉眼观察判定结果。LAMP反应是在恒温(63 65°C )条件下45 90分钟内完成。这种比较温和的温度条件以及没有温度循 环使所需仪器简单化，克服了传统PCR固有的检测时间长、容易污染及检测 成本高等缺点。此外，这种检测方法对检测人员的技术素质要求较低，实际操作极为简便，不需要特殊的试剂和仪器设备，有利于建立成本低廉的快速筛选体系。LAMP法是一种简便、快速、高度特异性的基因扩增法。将恒温 基因扩增技术与PCR技术(包括荧光实时定量PCR技术)进行比较，可以 发现该技术在灵敏度、特异性和检测范围等方法学指标上相当于或优于PCR 技术，且不依赖任何专门的仪器设备即可实现现场高通量快速检测，而且检 测成本远低于荧光定量PCR技术。国内目前尚未有这方面的试剂盒出售。目 前国家标准中以微生物分离培养和形态学鉴定为主、结合生化分析和血清学 分型鉴定的通行方法，初歩鉴定需2 3天，完成鉴定报告需10 15天；采 用本专利技术的基因快速诊断试剂盒仅需2小时。并且，本专利技术的反应液中加入 了显色液，鉴定结果更为直观清晰。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果l.本专利技术的基因快速诊断 试剂盒只需一个恒定温度就能扩增反应，不需要特殊试剂与设备，检测成本 低；2.本专利技术的基因快速诊断本文档来自技高网...
【技术保护点】
基于环介导等温扩增技术的甲型肝炎病毒基因快速诊断试剂盒，其特征在于由两对引物、Ｂｓｔ ＤＮＡ聚合酶、逆转录酶、ＲＮＡ酶抑制剂、稳定液、反应液、显色液和阳性对照液组成，以上八种液体分别置于容器中， 上述两对引物为： 外引物Ｆ３，其核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示； 外引物Ｂ３，其核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２所示； 内引物ＦＩＰ，其核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３所示； 内引物ＢＩＰ，其核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４所示； 上述反应液含有１．６～２ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ、２０～２５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ、１０～１２．５ｍｍｏｌ／Ｌ氯化钾、１０～１２．５ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸铵、８～１０ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸镁、０．１～０．１２５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、０．８～１ｍｏｌ／Ｌ甜菜碱、内引物ＦＩＰ／ＢＩＰ各１．６～２ｍｏｌ／Ｌ和外引物Ｆ３／Ｂ３各０．２～０．２５ｍｏｌ／Ｌ； 上述阳性对照为携带甲型肝炎病毒基因的质粒ＤＮＡ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：曹以诚，黄逸男，李志勇，杜正平，陈洵，谭惠媚，王志强，
申请(专利权)人：广州华峰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]
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