本发明专利技术涉及一种斑节对虾杆状病毒现场快速高灵敏检测试剂盒及检测方法。本发明专利技术的检测试剂盒包括：采样管、内装蒸馏水的漂洗管、内装ＴＥ缓冲液的核酸变性管、内装扩增反应液和核酸染料的扩增检测管、阴性对照管、阳性对照管、ＦＴＡ膜片及其快速干燥液等。本发明专利技术的检测方法具有比普通ＰＣＲ检测方法更高的特异性、灵敏性和便捷性，并且成本非常低，无毒，安全，使用方便，检测更准确、快速，且灵敏度极高，可以替代已有的相关检测方法如病理切片法、电镜观察法、抗体检测法和ＰＣＲ检测法。本发明专利技术的检测试剂盒和检测方法不仅可在室内的实验室使用，也可在野外的生产现场使用，对加强斑节对虾杆状病毒的流行病学监测和疾病防控意义重大，具有很高的推广应用价值。
【技术实现步骤摘要】
斑节对虫下杆糊毒鹏鹏高灵繊测翻叙检测方法狱繊本专利技术涉及海洋生物病原检测狱，具体賊界細下杆糊毒(MonodonBaculovirus，简称MBV) 的鹏腿高灵驗测翻叙離测旅。 背景狱梦f^他下杆TO毒，又名草虫下杆Wi毒(Grass Shrimp Bacubvirus)、珍11 X賴下型杆^i毒(Penaeus monodon-typeBaculovirus), :^—种3又链DNA杆>|^毒，MBV可以^^%^)(^下(Pe舰Mswo;70tfo")、 长^X拍下CP戸"z'd/to^)、墨吉又他下0 WCTgM/eraiy)、短沟)^f!下CP wwiswfca加)、新^!下等多禾中#5舰 野妇卿。彌毒严W^时可导敏卿幼体^E亡，娜職及熟魏穀潮员失，影响水产养 M的稳定和可機，。所以开m的技术鹏、 、灵 测MBV，加^^顶种和卿下检 疫以及辭l7K^r趟的监测，对挪方病^^染，切断病劍专播，僦餓国)^!下^M的MJt^^a^具 有觀意义。目前，有关MBV检测还主S^于病理切片法、电繊察法和PCR检测法。病理切片法不趟接 对病離行检则，只育猁用鍋的组织滴理征3隨行检测，并腿局限于在实驢内进行；电子显微镜 技术虽然可以直接观察到病^f立子的雜'但其操作鋭、耗费时间长、鹏性低；用抗W^则法检测 MBV虽^mi:优于病理切片法，但其灵i(S樹氐，在MBV尚未引^i^i^的极早期御糊抗 概樹则出来；MBV的PCR检测法，虽然剠艮了前面几禾1^法的缺点，在实驢^ft下能^J舰MBV 的丰朋矛鹏、翻樹则，但由于常规的PCR检测需要昂贵的PCR仪、繊电》好n成像系统，使得PCR检则齒隹以用节形汤的^i检测，这狀限制了 pcR检测方法在鹏ii妒中mr卿。
技术实现思路
本专利技术的目的是^t共一种适于^mfi自、',、高灵ma易操作的珍fWife下杆^^^测方法，并将检测方法标准化，同时将检测i叙i簾中于规范的淑嗆中，以划艮现有技术的不足，使MBV 的检测更翻、灵敏、鹏、安全和方便。首先，本专利技术禾偶针对MBV多角蛋白基因中保守区段设计的4鎌异引物和一种具有驢换活性 的DNA聚，，在恒定^ST对目的核mi4行扩增，实5J^tMBV的'I^S和高灵i^测。为了进一步 縮短检测时间、消除检测过程中可t拨生的污染、简idt测步骤，使检测实验倉辦在妒鹏l(开展，本 专利技术对MBV的实驢检测方^S行了优化。在用FTA卡片制备样品核酸的标准步骤中，需要稱座样品 匀浆液銜湿的FTA膜片在室温下书超少一个小时，然Jg才有^4W麟；本专利技术ffl3i^E鹏品匀浆液润 湿的FTA^)t上滴加亲7KM易挥发的S^f质(±^恳 、伯醇和仲醇)，使润湿的FTAJ1^^温斜牛下只需io溯即可^g千^l程，；Wi短了样品核麟恪的时间。在利用^a扩if^"法检测病 原时，目前普^OT扩增Si^束后向鹏管中添加核麟料以判断检测结果&^r法；由于^a扩增反应的，量非常大，这种打开鹏管彌鹏,料的雄极易导辦麟检样品被污染而使检测结果 出现假阳性；有ffiil和舒U細在扩增^S^试剂中添加尿嘧啶DNA糖割德(UNG酶)的方法消除污染风险，但却增加了 ;本专利技术先将核,料粘附到扩增^S管的内侧上方驢子内侧，W增鹏结束后再ffl3ii:下反鎮荡使扩增ra液和核麟料混合，这样不打开扩增反应管就能^r增，的 染色，消除了打开扩增ffi管s^加核m^料过程中H^M肖繊出w^纟,品被污染的风险。raFTA卡片希恪样品繊的标准步骤中，需要用Whatman公司(英国)专门的纯化微阪复激FTA膜 片；本专利技术无需专门的纯化淑U，翻普通的蒸馏水離即可誠FTA断的纯化，辦不仅简化了检 测鄉6^M作步骤，还斷氐了赫。为了使i^^法在^mt汤更具实用性，本专利技术^±^优化的教肚， 将检测MBV病毒所需的i凝ij与器材进行了组装，{狡标准化、配套化，形成了检测i叙嗆。 本专利技术的检测试齐睑包括(1) 采样管，用來盛放、研磨待检样品；(2) 漂洗管，内装蒸馏水；(3) 核^^性管，内装TE缓冲液；(4) 扩增检测管，内靴增ffi液和核^^料，扩增S/S游M^分如下扩增引物MBV-F1和 MBV-B1各1 2mM，扩增引物MBV-F2和MBV-B2各0.1^0.4nM， dAIP、 dTTP、 dGTP和dCIP各 0.8 2.0mM, MgCl24~10mM， Betaine (甜麯)0.6 1.2M， TriS"HCl 10 40mM， KC110 20mM， MgS04l 4mM, (NH4)2s046 12mM， TritonX-1000.05% 1.0%,具有Ha换活性的DNA聚娜2 20U;核麟料为肝生物對开究中常用的核麟料，包括但不限于S豫Green、 GelRed、 GelGreen、 GoldVieW 、 GeneFinde^等；且核麟料予^fe粘附于扩增检测管管壁内顿y上^W增检测管盖子内侧；(5) 阴'断照管，内装^^iTO^下杆TO離酸的FTA斷；(6) 阳'I4^照管，内對及附了斑1 )^下杆^毒核酸的打八皿；(7) '鹏千麟，为亲水胆易挥发的^ (8) FTAM>t、研磨棒、3^和吸管分别封装于无菌袋中；(9) ^^:，内装一土贿多个/』吼的泡沫 ^绵块；(10) 使用说明书。J^检测i凝i搶中戶腿的扩增引物是根据MBV多角蛋白基因保守瞎列设计的，^glgif列如下上游引物1: 5'-CCAGATrCCArAGGCAArAGArGAnTnTAGAATrCAACGATArGAACGG 下游引物1: 5'-AACAGACACTrATGAGATGCCArcrnTGATGArGTTGGTGTGCGG 上游弓物2: 5'"CTCCAGGGGATAArCCAAIT 下游引物2: 5'-TGAGGAGACTTCCAAGAGT 。用本专利技术的试剂維测細下MBV的方法，按下列步離行(1) 取样品) W下组织釣0.02 1.0 g置于采样管中，用研磨衛各样品) ^下组织麟M^状；(2) 用研磨棒M^状的样品3m下组织将FTAmH"充分润湿；(3) 吸取鹏千繊商于战FTA断上，静置l(K20min;(4) 用雅将战FTA断转移到at内，震顯i^t3 5min以洗涤FTA跳(5) 用3^将i^mt内的FTA斷转移到核艘性管内，95。C保温3 6min,让DNA双链充傳链，然后再ffl3IK于室温餅下2 5min,使FTA断上的核酸腿條两条单 态；(6) 再用3^将J^核,性管内的FTA斷转移到扩增检测管内，^T增检测管置于55 65t ^f牛下保温40 70min;(7) 榭广增检测管上下反ftM动l-3 min,使扩增S^液与粘附于扩增检测管管壁或管ai:的核酸 染料充分混匀；(8) 用力向下甩动扩增检测管，使管内混有核^f斗&wms^^i于扩增检测管底部，朋鹏 观察as液，如果Mjs^sj形絶则^^样品的mbv检测结果为阳性，如果s^^M5jam黄色则表^i^样品的MBV检测结果为阴性。SLhM步骤中，(4)步开始应榭乍为阴ti^照的^^mjlfe下杆Wi毒核酸的FTA斷、作 为附,照的吸附了斑节)(^下杆>1^毒核酸的FTA膜片，以及吸附了样品核酸的FT本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种斑节对虾杆状病毒现场快速高灵敏检测试剂盒，其特征是该检测试剂盒包括： （１）采样管，用来盛放、研磨待检样品； （２）漂洗管，内装蒸馏水； （３）核酸变性管，内装ＴＥ缓冲液； （４）扩增检测管，内装扩增反应液和核酸染料； （５）阴性对照管，内装无斑节对虾杆状病毒核酸的ＦＴＡ膜片； （６）阳性对照管，内装吸附了斑节对虾杆状病毒核酸的ＦＴＡ膜片； （７）快速干燥液； （８）ＦＴＡ膜片、研磨棒、牙签和吸管分别封装于无菌袋中；（９）包装盒，内装一块有多个小孔的泡沫板或海绵块； （１０）使用说明书。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张庆利，黄倢，宋晓玲，刘莉，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：95[中国|青岛]
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