扇贝急性病毒性坏死病毒核酸等温扩增检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术涉及一种扇贝急性病毒性坏死病毒核酸等温扩增检测试剂盒及检测方法。试剂盒包括ＳＥＭＰ采样液、核酸抽提液、ＬＡＭＰ反应液、显色剂和ＡＶＮＶ阳性对照核酸等试剂和多种器材。检测方法是以扇贝急性病毒性坏死病毒基因保守区序列设计的４条引物对扇贝急性病毒性坏死病毒的特异性核酸片段进行定性检测，简便快速，灵敏度高，特异性好，特别是方便用于现场的快速检测。利用本发明专利技术仅需一个水浴锅即可在２小时内准确检测出扇贝和养殖水体中低至３０个拷贝的病毒粒子。可用于扇贝养殖过程中各时期的病毒跟踪检测，有望替代组织病理学方法、电子显微镜技术、免疫学方法和ＰＣＲ检测等方法。

【技术实现步骤摘要】
扇贝急'TO毒性i^E病^^酸，扩增检测试剂^^检测方法駄领敏本专利技术属于贝^原检测
，具術步及一种扇贝急性病毒性i^E^毒(AVNV， Acute Viral N國isVirus)核酸離扩增检测i叙U叙微测方法c 背景駄自20跟己90年代以来，怖孑Ll贝的:^脚^Et^我国北方辭直海区3i^暴发(累积應亡率高达 90%以上)，给扇贝#31 ^了巨大的经游员失，并严重阻碍了这一产业的機赚。AVNV是引娜 孑固贝夏季大夫艰^E亡的直鶴原。目前，对于AVNV^^铺效的治^r法，樹亍扇贝 #§1技术 是最W^的预P^t施，而这主對繊于早期的'^I检测。因此，研发鹏、M、灵敏和实用的检测技 术，加强苗种和成贝鹏以及^M7K^^鴻的监测，对明确病 #播途径，制^t^的防治措施，以保障扇贝靜她的鶴撫卖赚具^m意义。目前，对于A丽的检测方法主要包括传鄉彌理学施、电子显微镜狱、免疫学施(主要 ^免疫吸附微ELISA、间接免疫荧光检测法)和被电镜,[I聚^^;鹏(PCR)等。这 些检测方法有徵万需要辦才料希恪熟贞，操作鋭，费用高，有敏微斜顿求高，樹则时间长，有些方法灵繊不高，特异性不强，M性樹氐。因此，操作人员掌握关键的检测fe7^feg大，难以用于瓛ll樹则，限制了a^^术在u^的检测、被的細。环介导^M扩增(Loopmediated Isothermal Amplification,简^LAMP技术)，^fi^来^M^的 一种^W離异核斷段的技术，由于其操作简便、'腿、灵敏、特异蹈駢可用于鹏检测辦点， 因 #51^实践中具 的自价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了^艮已有检则狱的S^限性，石雕'J一种扇贝急'醜毒性i^穀亥M^ 扩增检测试剂叙微测施，鹏贝急醜毒性i^毒的检测更繊、灵敏、鹏、錢和方便。本专利技术^S于2000年由Notomi等专利技术的环介导^T增技术。本专利技术针对AVNV基因保守序列 的6个区段，设计4斜寺异引物并利用一种具有髓换活性的DNA聚彌，在一定a^T又报Ma行 ^a扩增。禾,该4条LAMP引物，可以特异粗魁广增麟AVNV待检样品的有幾因片段，所粒 的优化LAMP樹则体系保证飽则结果的鹏性、糊性和稳定性。砂激壯优柳设计，将检测方法 标准化，配套化，同时将检测试齐瞧中于规范的淑U盒中，Jli乓扇贝急'醜毒性i^毒的基因诊臓 剂紐检测施。本专利技术的扇贝急I^毒性^E病毒的基因诊,U盒由下列部件构成(1) 研磨液，l管，内装SEMP采样液，SEMP采微由以下组伤^贼1M的三羟甲基錢甲垸 (Tris-HCl， pH8.0): 0.5 15fe、； 0.5 M的乙二胺四乙酸二钠(EDTA): 0.5 15份；10%的十二^§1,(SDS): 0.5 15份；统基乙醇0.01 0.5份；平衡舊10 30份；双穀JC:定糊100份；(2) 核翻提液A， l管，内装浓度为4M的乙M， pH为5,2;(3) 核,提液B， l管，内^7乂乙醇；(4) 核,提液C， l管，内装70%的乙瞎(5) TE缓冲液，l管，内装TE缓冲液(lOmMTris-HCl和lmMEDTA， pH8.0);(6) LAMP^S^液，l管，内装LAMP^Z液，包括双蒸^C、 MgCl2、 dNTP、 Betaine (甜 )、 Tris-HCl 、 KC1 、 MgS04、 (NH^SQ^ Triton X-100、 LAMP内引物AVNV-FIP和AVNV-BJP、 LAMP 夕卜弓胸AVNV-F3和AVNV-B3以及5对DNA聚娜；(7) 显色剂，l管，内装核麟料GeneFinder頂；(8) 阳'M照核酸，l管，内装AVNV阳'I4^粒DNA;(9) 研磨棒，4支；(10) 盒子；(11) 一i^^:子中的泡沫板，其上有Mi^各小管的多个/J吼。上述的LAMP弓物是鹏AVNV基因保守EJ^列设计的，LAMP弓嫩设计的软件是PrimerExplore 4.0 (http:〃primercxplora:jp /elamp4.0.0/index. html) 。 LAMP弓l物的DNA序歹收口下 AVNV-FIP: 5'-GACATCTGGCGGTArnTCAATATGTmTGCAGnTAAATCTCCCAAC AVNV-BIP: 5'-GGTTAGArCTACAATTGCGCCArnTCACCATrcrnTGACACAGG AVNV-F3: 5'-GTGCTGAGACGGAATGTG AVNV隱B3: 5'-TGGATGACACCCTTATGC用本专利技术J^淑lj^^测扇贝急'醜毒性i^毒的方法，按下列步lia行(1) TO贝样品的夕瞎膜、肾^FMI楚且雜勺0.02 0.06g置于离心管中，力口入200nL研磨液，用 研磨驗样品充分磨碎致状；(2) 4執开磨好的样品以5000 10000r/min，离心2 5min，取100pL上清體^f 的离心管中；(3) 力口入核^i取液A中鹏为4M的乙,，上下颠倒混匀，再加入核^i取液B中-20 。C 予敏令的^7jC乙醇，并上下颠倒充分混合，以10000 15000r/min离心5 10min，小ll弃上清液保留沉淀 物；(4) 用核^I取液C中浓度为70%的乙醇洗涤±^沉淀物，然后以10000 15000r/min离心5 10 min，弃上清液保留沉淀物；(5) 重复步骤(4) 一次，然后将离心管底M:淀物置于室温晾干，力口入50 100nLTE缓冲液溶 M^淀物，ff^品的核酸；(6) 将Jd^样品核酸和阳'l4Xt照核^"AVNV阳'I4M粒DNA于95 。C保温3 5 min，让DNA双 舰爐链，然后再ffiiia于蹄烛中2 5min，目的劍吏繊廳鹏呈两条单舰态。(7) ^Lh^d3ijS的样品核酸和阳'teXt照核酸分别置预的小管中，向齡小管中分别力DALAMP 鹏瓶并混匀；(8) 将J^小管于59 64T保温45 70min，然后于80T保温3 5min进行LAMPg;(9) LAMP ffi^束后，向^M、管中力口入GeneFinder1^并混匀，然后肉目歐见^i孵品的LAMP ^i^果，如腿恭ffe则^^样品的AVNV检测结果为阳性，如驟示橙黄色则^i^样品的AVNV樹则结果为阴性。本专利技术的有^^^在于在试齐睑中包括AVNV检测所需的SEMP采样液、核,提液、LAMP 反应液和显色剂等试齐诉口器材，使得A丽fi^测育辦简便、'鹏陏序鹏行，实现了检测过程的程 m^n标准化；本专利技术的试剂^^检测方法是以t離AVNV基因保守,列设计的4条LAMP弓鹏为 主体设计的，使AVNV检测完全具有了LAMP技糊便腿、灵敏、特异和可用节贴汤检测的特点； {顿本专利技术的微1^^检测方法在2小时内就可5^g AVNV的检测，检测过禾玩需昂贵的仪器设备如 PCR仪称^^像系统，仅需要水^I呙^M浴和离心机即可，具w^r用于^t汤检测的优点，而且检测结果肉眼可以判别；与AVNV己有检测技糊比，本专利技术的试剂舒B樹则方法具有更高的特异性、灵敏 性和便捷性，MM ， ^3i程稀及有毒试剂，鹏乍人员和环凝,常錢，检测灵i^低 至30个病毒拷贝；^f顿本专利技术的i叙U^^检测方法，可以在劍牛相鹏陋的实^^tJ本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种扇贝急性病毒性坏死病毒核酸等温扩增检测试剂盒，其特征是该试剂盒包括：　（１）研磨液，１管，内装ＳＥＭＰ采样液；　（２）核酸抽提液Ａ，１管，内装浓度为４Ｍ的乙酸钠，ｐＨ为５．２；　（３）核酸抽提液Ｂ，１管，内装无水乙醇； 　（４）核酸抽提液Ｃ，１管，内装７０％的乙醇；　（５）ＴＥ缓冲液，１管，内装ＴＥ缓冲液，包括１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ和１ｍＭＥＤＴＡ，且ｐＨ为８．０；　（６）ＬＡＭＰ反应液，１管，内装ＬＡＭＰ反应液，包括双蒸水、ＭｇＣｌ ↓［２］、ｄＮＴＰ、Ｂｅｔａｉｎｅ、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ↓［４］、（ＮＨ↓［４］）↓［２］ＳＯ↓［４］、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００、ＬＡＭＰ内引物ＡＶＮＶ－ＦＩＰ和ＡＶＮＶ－ＢＩＰ、ＬＡＭＰ外引物ＡＶＮＶ－Ｆ３和ＡＶＮＶ－Ｂ３以及Ｂｓｔ　ＤＮＡ聚合酶；　（７）显色剂，１管，内装核酸染料ＧｅｎｅＦｉｎｄｅｒ↑［ＴＭ］；　（８）阳性对照核酸，１管，内装ＡＶＮＶ阳性质粒ＤＮＡ；　（９）研磨棒，４支；　（１０）盒子；　（１１）一块装于盒子中的 泡沫板，其上有放置上述各小管的多个小孔。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王崇明，任伟成，蔡玉勇，黄倢，张庆利，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：95[中国|青岛]