一种结核分枝杆菌快速药敏检测试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术涉及一种结核分枝杆菌快速药敏检测试剂盒及其检测方法。所述结核分枝杆菌快速药敏检测试剂盒包含有标本处理试剂、分离纯化试剂、药敏培养试剂、细胞活性检测试剂，其中细胞活性检测试剂为ａｌａｍａｒ　ｂｌｕｅ指示剂。采用本发明专利技术的试剂盒及结果分析方法可较传统的方法在阳性检出率上有很大提高，在得出结果时间上大大提前，整个试验在３天内能够得出结果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分枝杆菌药敏检测领域，具体涉及一种结核分枝杆菌快速药敏 检测试剂盒及其检测方法。(二)
技术介绍
作为一种古老的传染病，结核病的疫情在全球呈上升趋势。据WT0估计， 目前全世界约有20亿人感染结核杆菌，每年有800万新发病例和300万人的 死亡。在我国，根据2000年第四次全国结核病调查估算，全国约有5. 5亿结 核病例，将近全国人口的一半。我国目前结核病的形式严峻。尽快建立先进的 诊断技术和治疗措施，是一个紧迫的任务。不仅关系到千万人身心健康，也是 关系到国民生计和国家经济发展的重要问题。当前各医院及医疗机构在治疗结核病的过程中仍然沿用传统的方法即从 病灶部位或痰中分离活的菌体，分离培养进行纯化，挑取纯化的细菌进行药敏 实验。由于结核分枝杆菌生长緩慢一般需20-30天左右，而药敏实验同样需要 20-30天，整个药敏试验需要2-3个月才能得到结果，这样就严重影响病人的 及时正确用药。临床医生往往为了减轻病人的痛苦，在没有药敏结果的情况下 凭经验先给病人用药，这就带有很大的盲目性，这也是当前结核杆菌耐药率非 常高而且结核病的死亡率高的主要原因，严重影响人们的健康。(三)
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种结核分枝杆菌快速药敏检测试剂盒及其检测 方法，能够实现结核分枝杆菌药敏性的快速检测。 本专利技术采用的技术方案如下一种结核分枝杆菌快速药敏检测试剂盒，包含有标本处理试剂、分离纯化 试剂、药敏培养试剂、细胞活性检测试剂，其中所述的细胞活性检测试剂为alamar blue指示剂。所述的分离纯化试剂包括纳米免疫磁性微珠，免疫磁性微珠上包被有结核 分枝杆菌特异性的膜抗体。所述的标本处理试剂是氢氧化钠和半胱氨酸， 一般氢氧化钠的质量浓度为4%。所述的药敏培养试剂包括培养基、选择剂、结核分支杆菌生长因子、抗结 核分支杆菌用一线及二线抗生素，抗生素分为低浓度和高浓度两种，同时设有 空白对照。以上所述的标本处理试剂、分离纯化试剂、药每文培养试剂、alamar blue 指示剂都可以直接购买市售产品得到。本专利技术还提供了一种所述结核分枝杆菌快速药敏检测试剂盒的检测方法， 具体如下先用标本处理试剂处理标本使之液化，然后利用纳米免疫磁性微珠 富集纯化标本，之后将免疫磁性微珠加入药敏培养试剂中进行培养，培养试剂 中加入浓度为8-12%的细胞活性指示剂alamarblue，培养温度为35-3rC的条 件下培养48-72h;然后利用分光光度计、荧光检测仪或目测方法进行检测。本专利技术旨在通过alamar blue细胞活性指示剂的加入来实现快速检测培养 液颜色的变化，进而推算结核分支杆菌的抗生素敏感情况， 一般药敏培养三天 后即可观察到药敏培养液的变化。其原理如下将结核分枝杆菌在不同药物浓 度下培养，同时向培养基里添加细胞代谢指示剂即alamarblue指示剂，在结核 分支杆菌对抗体不敏感的情况下，细胞代谢旺盛，细胞内NADPH/NADP、 FADH/FAD、 FMNH/FMN和MDH/NAD的比值升高，处于还原环境。4聂入细月包内的 染料被这些代谢中间体及细胞色素类还原后释放到细胞外并溶于培养基中，使 培养基从无荧光的靛青蓝变成有荧光的粉红色。最后用普通分光光度计或荧光 光度计进行检测或目视，吸光度和荧光强度与活性细胞数有关。将检测结果与 空白对照孔比较，来判断该结核分支杆菌对该药物的敏感情况。目测液体培养液的颜色，如果培养液的颜色与空白对照的颜色接近即培养 液由紫蓝色变为淡粉红色说明该株结核分支杆菌耐药，如果培养液的颜色无变 化则说明对抗生素壽丈感；用分光光度计检测培养液的吸光度，如果培养液的吸 光度与空白对照的接近说明该抹结核分支杆菌耐药，如果培养液的吸光度比空白对照的大则说明对抗生素敏感；用焚光检测仪检测培养液的萸光强度，如果 培养液的荧光强度与空白对照的接近说明该抹结核分支杆菌耐药，如果培养液 的荧光强度比空白对照的小则说明对抗生素敏感。本专利技术进一步通过免疫磁珠的吸附作用分离和纯化结核分支杆菌，将富集 的病人标本直接加入药敏培养试剂里，然后进行药敏试验，通过免疫磁珠的富 集纯化作用，基本上可将传统的分离纯化时间由20-30天缩短为1-2天。本专利技术相对于现有技术，有以下优点采用本专利技术的试剂盒及结果分析方法可较传统的方法在阳性检出率上有 很大提高，在得出结果时间上大大提前，整个试验在3天内能够得出结果。具体实施例方式以下以具体实施例来说明本专利技术的技术方案，但本专利技术的保护范围不限于此实施例1本专利技术所用试剂盒，包含有标本处理试剂、分离纯化试剂、药敏培养试剂、细 胞活性检测试剂。其中标本处理试剂为4。/。的氢氧化钠和N-乙酰-L-半胱氨酸； 所述的分离纯化试剂为包被有结核分支杆菌的特异性膜抗体的纳米免疫磁性 微珠；所述的药敏培养试剂为7H9培养基，其中含有抗结核分支杆菌用抗生素 链霉素、利福平、异烟肼、乙胺丁醇、左氧氟沙星，抗生素分为低浓度和高浓 度两种，同时设有空白对照。所述的细胞活性检测试剂为alamarblue指示剂。 检测过程如下将结核分支杆菌的特异性膜抗体包被在纳米免疫磁性微珠上备 用。取一份镜鉴阳性的病人痰标本，用标本处理试剂(4y。的氢氧化钠和N-乙酰 -L-半胱氨酸)处理使得液化后，加入特异性的免疫磁性微珠，充分搅动使得 结核分支杆菌全部结合在免疫磁珠上，收集免疫磁珠，得到富集和纯化的结核 分支杆菌，用无菌的生理盐水洗涤》兹珠三遍除去杂菌；用加样枪等量吸取免疫 磁珠100ul加入各药敏孔中，同时设两孔不含抗生素的空白对照孔，向培养孔 中添加含10% (wt%) alamar blue的结核分支杆菌选择性培养基7H9培养基，培养基中含有甘油、胎牛血清及无机盐等生长因子和抑制杂菌的抑菌剂。3rc培养48小时。观察或检测培养结果，并与空白对照孔进行比较。结果如下药敏孔空白孔链霉素利福平异烟肼乙胺丁醇左氧氟沙星 颜色 粉红色 蓝色 蓝色 粉红色 蓝色 蓝色 药敏结果 敏感 敏感 耐药 敏感 敏感权利要求1. 一种结核分枝杆菌快速药敏检测试剂盒，包含有标本处理试剂、分离纯化试剂、药敏培养试剂、细胞活性检测试剂，其特征在于所述的细胞活性检测试剂为alamar blue指示剂。2. 如权利要求1所述的结核分枝杆菌快速药敏检测试剂盒，其特征在于所述的 分离纯化试剂包括纳米免疫磁性微珠，免疫磁性微珠上包被有结核分枝杆菌特 异性的膜抗体。3. 如权利要求1所述的结核分枝杆菌快速药敏检测试剂盒，其特征在于所述的 标本处理试剂是氢氧化钠和半胱氨酸。4. 如权利要求1所述的结核分枝杆菌快速药敏^r测试剂盒，其特征在于所述的 药敏培养试剂包括培养基、选择剂、结核分支杆菌生长因子、抗结核分支杆菌 用一线及二线抗生素，抗生素分为低浓度和高浓度两种，同时设有空白对照。5. 如权利要求l-4之一所述结核分枝杆菌快速药敏检测试剂盒的检测方法，其 特征在于先用标本处理试剂处理标本使之液化，然后利用纳米免疫磁性微珠富 集纯化标本，之后将免疫磁性微珠加入药敏培养试剂中进行培养，培养试剂中 加入浓度为8-12%的细胞活性指示剂alamarblue,培养温度为35-37"C的条件 下培养48-72h;然后利用分光光度计、荧光检测本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种结核分枝杆菌快速药敏检测试剂盒，包含有标本处理试剂、分离纯化试剂、药敏培养试剂、细胞活性检测试剂，其特征在于所述的细胞活性检测试剂为ａｌａｍａｒ　ｂｌｕｅ指示剂。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：付光宇，娄斌，苗兰芳，胡英会，陆影楠，吴学炜，
申请(专利权)人：郑州安图绿科生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：41[中国|河南]