修饰肽的方法和鉴定肽的方法技术

本发明专利技术意欲提供简单地和特异性地修饰组成肽的特定氨基酸残基的方法，并且提供使用关于通过详细说明由所述特异性修饰方法修饰的氨基酸残基的数目而获得的肽的新信息来提高鉴定肽的精确度的技术。根据本发明专利技术修饰肽的方法的特征在于：将固定在支持物上的肽和包含醇的全卤化羧酸水溶液反应，由此选择性地酯化所述肽的谷氨酸残基。根据本发明专利技术鉴定肽的方法的特征在于所述方法包括下列步骤：使固定在支持物上的肽与包含醇的全卤化羧酸的水溶液反应，以选择性地酯化所述肽的谷氨酸残基；通过将所述支持物浸入蛋白酶溶液中以获得来自所述肽的肽片段；测量所述肽片段的分子量；和基于所述分子量鉴定所述肽。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及修饰肽的方法和使用该方法鉴定肽的方法。
技术介绍
对于研究天然肽和蛋白(在下文，也恰当地称为"肽")的生物学特征 和功能，氨基酸序列的信息是不可缺少的。目前，基于相应的基因信息，即编码这些氨基酸序列的基因组基因和由mRNA制备的cDNA的碱基序 列，将氨基酸序列如肽和蛋白的氨基酸序列确定为推导的氨基酸序列。此 外，通过直接分析肽的序列的任何方法确定蛋白质的这些氨基酸序列。在 这些情形中，仍旧需要肽的氨基酸序列的信息来详细说明编码肽的基因组 基因和制备自mRNA的cDNA。获得氨基酸序列的信息的方法包括肽质量指纹(PMF)法。所述方法是 基于信息如分子量鉴定起始肽的方法，其中将例如在SDS-PAGE中经电泳 分离的条带切下，使用蛋白水解酶如切割位点特异性的蛋白酶将所述条带 消化为多个肽片段，并且根据质量分析测量每个肽片段的信息如分子量。 为了使用该方法以足够的精确度鉴定所述肽，通过消化肽产生至少4-5个 肽片段是必要的。然而，在待测量的具有低分子量的肽情形中，通常是经过蛋白水解酶 的处理获得的肽片段的数目是有限的这样的情形。此外，甚至在待测量的 具有高分子量的肽的情形中，认为不能获得足够数量的肽片段，因为通过 用蛋白水解酶消化所述肽获得的肽片段的数目取决于蛋白水解酶的作用 方式。使用PMF方法提高鉴定肽的精确度的方法包括比较由一些蛋白水解 酶消化获得的肽片段的质量分析的光谱的方法。但是，在这种方法中，将 获得很多光谱，并且获得待比较的多个峰，由此使鉴定变得复杂。此外，另一种方法包括比较由所述肽获得的修饰前和修饰后的肽片段的分子量的方法，例如通过非特异性地修饰组成所述肽的氨基酸残基。然 而，该方法具有这样的问题，即追踪/比较在修饰前片段和修饰后片段之间 的变化的步骤是复杂的，因为所述肽不是被特异性地修饰。此外，另一种方法可以包括比较使用酶特异性修饰肽的氨基酸残基而 获自所述肽的修饰前和修饰后的肽片段的分子量的方法。然而，使这样的 酶在凝胶中反应是困难的。此外，该方法具有这样的问题，即在修饰反应 后获得分子量信息的步骤中，由进行蛋白水解酶的裂解处理的修饰酶来源 的酶片段影响被靶向的肽片段的峰。因此，该方法不是方便的。此外，甚至在理论上可以获得足够数目的肽片段的情形中，因为包括 相当大的电离趋势的异质性和抑制作用的多个作用， 一些获得的肽片段可 能在使用质量分析的分子量测量中没有被观察到。甚至在任何情形中，存在提高使用PMF方法鉴定所述肽的精确度的需要。应该注意的是，本申请人不能发现在本申请提交前，任何涉及本专利技术 的已经公布的现有技术文献。因此，现有技术文献的信息没有被公幵。公开内容概述 本专利技术待解决的问题本专利技术基于上述提及的问题进行，并提供容易地和特异性地修饰组成 肽的特定氨基酸残基的方法。此外，本专利技术通过提及的所述特异性修饰方 法，提供使用获自许多修饰的氨基酸残基的肽的新信息来提高鉴定肽的精 确度的方法。解决问题的方法
本专利技术所述的修饰肽的方法的特征在于一种修饰肽的方法，其中将由基底支持(s叩ported)的肽和包含醇的全卤化羧酸水溶液反应，以选择性地酯化所述肽的谷氨酸残基。此外，本专利技术所述的鉴定肽的方法的特征在于 鉴定肽的方法包括下列步骤使由基底支持的肽和包含醇的全囱化羧酸的水溶液反应，以选择性地 酯化所述肽的谷氨酸残基；将所述基底浸入蛋白酶溶液中以获得来自所述肽的肽片段； 测量所述肽片段的分子量；和基于所述分子量确定所述肽。 专利技术效果根据本专利技术，特异性地修饰在基底中的肽的谷氨酸残基是可能的。此 外，根据作为这种修饰方法的结果，组成所述肽的谷氨酸的数目，肽的鉴 定精确度得以提高。附图简述图l显示马肌红蛋白的序列，用胰蛋白酶消化的消化片段的推导的序 列和消化片段的观察的序列。图2是显示根据本专利技术的方法获得的肌红蛋白的质量分析的光谱的 图，其中其谷氨酸残基被酯化，其中(A)对应于马肌红蛋白的胰蛋白酶消 化，和(B)对应于其谷氨酸残基被酯化的马肌红蛋白的胰蛋白酶消化。图3是肌红蛋白的134-139残基(片段a)的质量分析的光谱，其中在上 面的光谱没有对应于进行本专利技术的反应步骤，而在下面的光谱对应于进行 本专利技术的反应步骤。图4是肌红蛋白的32-42残基(片段b)的质量分析的光谱，其中在上面的光谱没有对应于进行本专利技术的反应步骤，而在下面的光谱对应于进行本 专利技术的反应步骤。图5是肌红蛋白的64-77残基(片段c)的质量分析的光谱，其中在上面 的光谱没有对应于进行本专利技术的反应步骤，而在下面的光谱对应于进行本 专利技术的反应步骤。图6是肌红蛋白的119-133残基(片段d)的质量分析的光谱，其中在上 面的光谱没有对应于进行本专利技术的反应步骤，而在下面的光谱对应于进行 本专利技术的反应步骤。图7是肌红蛋白的17-31残基(片段e)的质量分析的光谱，其中在上面的光谱没有对应于进行本专利技术的反应步骤，而在下面的光谱对应于进行本 专利技术的反应步骤。图8是肌红蛋白的17-31残基(片段f)和80-96残基(片段g)的质量分析 的光谱，其中在上面的光谱没有对应于进行本专利技术的反应步骤，而在下面 的光谱对应于进行本专利技术的反应步骤。图9是肌红蛋白的103-118残基(片段h)的质量分析的光谱，其中在上 面的光谱没有对应于进行本专利技术的反应步骤，而在下面的光谱对应于进行 本专利技术的反应步骤。实施本专利技术的最佳方式(根据本专利技术修饰肽的方法) 根据本专利技术修饰肽的方法的特征在于一种修饰肽的方法，其中将由基底支持的肽和包含醇的全卤化羧酸水 溶液反应，以选择性地酯化所述肽的谷氨酸残基。在本专利技术中，所述基底不受限制，只要其是能够保持所述肽的凝胶组 合物，并且包括例如聚丙烯酰胺凝胶。所述基底可以是不仅用于常规一维 SDS-PAGE，还用于二维电泳，如凝胶电泳的一员(member)。在本专利技术中，所述醇不受限制，只要其是包含能够与氨基酸残基进行 酯化反应的醇式羟基的化合物，并且可以是，例如，具有l-5个碳原子的醇。 醇的实例包括低级醇如甲醇，乙醇，丙醇和丁醇。其中，优选甲醇。此外， 醇的除了轻基之外的原子团可以是具有各种质量的原子团，并且包括，例 如在氢，2H和具有其的基团的情形中。这些原子不受限制，只要其不抑 制如上提及的醇与氨基酸残基的酯化反应。在本专利技术中，所述肽可以包含或可以不包含谷氨酸残基。所述肽可以 是这样的肽，其包含分子内键合如S-S键合，与金属配位，根据氧化还原 状况改变侧链的状态，并且可以进行翻译后修饰如磷酸酯和糖链。在S-S 键合空间抑制试剂攻击谷氨酸的情形中，本专利技术可通过根据常规方法还原 反应物以裂解S-S键合而应用。此外，肽的分子量不受限制，只要其可以 保持在基底中，并且可以是但不限于在7-200 KDa的范围内。在本专利技术中，所述全卤化羧酸不受限制，只要其包含低级碳链，并且 还包含任何卤素原子如氟和氯。例如，其包括三氯乙酸，三氟乙酸，五氟 丙酸和七氟丁酸。其中，根据向基底的渗透性，优选三氟乙酸。在本专利技术所述的修饰肽的方法中，可以适当调节反应条件如温度，时间，浓度和pH。反应温度不受限制，只要所述肽没有被从基底洗脱，并且可以将液相保持在液体状态。所述温度可以优选地在0-4(TC范围内，更优选地在20-4(TC范围内，并本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种修饰肽的方法，其中使由基底支持的肽和包含醇的全卤化羧酸水溶液反应，以选择性地酯化所述肽的谷氨酸残基。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：宫崎贤司，田伏洋，皆川宏贵，齐藤惠美子，上条宪一，次田晧，
申请(专利权)人：日本电气株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]