以酶联免疫测定为基础的HLA补体依赖性细胞毒性抗体检测方法和试剂盒技术

本发明专利技术根据免疫学中补体依赖性细胞毒性（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔＣｙｔｏｔｏｘｃｉｔｙ，ＣＤＣ）反应原理，建立了一种测定ＨＬＡ补体依赖性细胞毒性抗体（ＣｏｍｐｌｅｍｅｎｔＦｉｘｉｎｇＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；ＣＦＡｂｓ）测定的体外酶联免疫反应方法及试剂盒。该反应系统由固相的ＨＬＡ抗原或具有ＨＬＡ抗原的靶细胞以及液相酶标配体组成。受检样品中的ＣＦＡｂｓ与固相ＨＬＡ抗原或靶细胞的ＨＬＡ抗原结合并同时固定存在于反应系统中的酶标记补体或以酶标抗补体抗体与固定于ＨＬＡ抗原－ＣＦＡｂｓ复合物中的补体结合，然后加入相应的酶底物产生酶学显色反应；由于该显色信号的强度与样品中的ＣＦＡｂｓ浓度呈正比关系，因此通过测定这种酶学显色的光密度吸光值（ＯｐｔｉｃａｌＤｅｎｓｉｔｙ；ＯＤ）即可达到对样品ＣＦＡｂｓ有无及其相对含量的测量。在以细胞为基础的反应系统中，引入针对细胞表面特征性标记（如ＣＤ等）的抗体，用以识别分离特定细胞群体，可实现对发生在该细胞群体ＣＤＣ效应的特异性测量。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术以免疫酶学反应为方法学基础，通过测定CFAbs固定补体量实现对样品中CFAbs测量的一种CDC效应评估方法。特别涉及器官移植免疫中HLA血清方法学的基本测定原理。二、技术背景组织器官移植中排斥反应是生物机体免疫系统对外来移植物(非已)产生的免疫应答反应。当移植物细胞表面的蛋白成分(非已抗原)与受者免疫系统接触时，通过免疫识别这些非已抗原成分并激发受者体液免疫系统、细胞免疫系统对移植物发动免疫攻击，破坏、排斥非已移植物，导致组织器官移植失败。组织器官移植中，受者免疫系统通过MHC(组织相溶性复合物)识别机制对移植物MHC表型及短肽复合物进行双重免疫识别。在人类MHC称为人类白细胞抗原(HLA)，如果移植供者与受者HLA型别不相符合，则受者免疫系统将移植物识别为非已并对其发生免疫应答，导致“免疫排斥反应”。在这种免疫排斥反应中，超急性免疫排斥反应主要由受者体液免疫成分即受者体内在移植前已经存在的，针对供者HLA的抗体分子所介导。这些抗体由受者怀孕、接受输血、器官移植等使其免疫系统接触非已HLA分子而产生。这类抗体的特征是能迅速与供者HLA结合并通过固定补体，激活补体系统发生级联反应，诱发CDC效应。这种超急性免疫排斥反应发生异常迅速，通常为几分钟到数小时；而急性、慢性免疫排斥反应则由受者的体液免疫及细胞免疫系统同时介入。因此，为了预防器官移植中免疫排斥反应的发生，除尽量选择HLA型别与受者HLA型别相匹配的供者外，在移植前利用供者淋巴细胞与受者血清进行交叉配型，以鉴别受者体内是否存在针对供者HLA的抗体是预防超急性排斥反应发生的关键。同时，在器官移植后，对受者体内HLA抗体的检测，包括PRA(群体反应性HLA抗体)动态测定对急性、慢性排斥反应发生的监测以及移植后受者生存期限的预测具有极其重要价值。根据抗体是否能够固定激活补体，诱发CDC效应与否，人类HLA抗体主要可分为两类一类为与相应的HLA结合后可固定补体并激活补体系统诱发CDC效应，该类HLA抗体称为补体依赖性细胞毒性抗体(Complement-dependent Cytotoxic Antibodies；CDC-Abs)或补体固定性HLA抗体(CFAbsComplement Fixing Antibodies)；其在诱发免疫排斥反应中的作用已十分明确，是直接导致免疫排斥反应尤其是超急性免疫排斥反应的体液免疫成分；而另一类HLA抗体，虽能与HLA发生特异性结合，但并不固定补体，不激发CDC效应，称为非补体固定抗体(Non-CFAbs；Non-Complement Fixing Antibodies)。此类抗体甚至在机体免疫系统没有接触任何非已HLA的情况下，以天然形式存在于人类身体内；并可与自身(Autologous)或外来(Allogeneic)非已HLA分子结合，但并不激活补体，诱发免疫CDC攻击效应。迄今，人们对这类抗体的作用并不十分明了。但多数学者认为，这些抗体属于一种天然抗体(Natural Antibody)成分，对生物体具有保护作用。美国、法国等曾对此作过较为深入的研究，体外、体内大量实验以及临床实验结果都获得完全一致结论即正常人体内存在天然抗体，由于其具有免疫调节功能，对维持正常生物机体健康发挥着某种有益的保护作用(Protective Effects)并可有效地应用于抑制器官移植中的免疫排斥反应。目前，国际上对HLA抗体测定的方法分为两类一类为Terasaki’s微量淋巴细胞毒性试验，简称为CDC血清学方法，是一种普遍认为经典的标准CDC测定方法。该方法以CDC诱发的淋巴细胞死亡率作为评判标准，其主要特征是直接测定由CFAbs诱发的CDC最终效应-细胞死亡，为一种CDC生物效应测定方法。该方法已广泛应用于临床器官移植的交叉配型以及PRA测定；但其存在费时长、技术复杂、实验条件不易控制等很多缺点。另一类方法可同时测定CFAbs和Non-CFAbs；包括流式细胞仪测定结合于细胞表面的IgG抗体测定法，或以纯化的HLA包被固相颗粒的抗HLA抗体测定法；以及使用纯化HLA包被96孔微孔板测定与HLA结合的IgG抗体ELISA方法等。这些方法最大的缺点是忽略了天然HLA抗体的存在(Non-CFAbs)，它们并不引起CDC效应；相反，这些抗体与相应的HLA结合后，可封闭该HLA抗原位点，阻止HLA毒性抗体-CFAbs与相应HLA结合，从而阻断随之发生的CDC效应，使受者产生对移植物的免疫耐受。因此，上述这类方法在检测方法学原理上存在明显缺陷，不能区别作用完全不相同的以上两类抗体。这就是为什么许多实验室经常得出令人难以解释或与CDC血清学相互矛盾的结果，甚至与受者临床转归完全相反结果如接受正常人免疫丙种球蛋白(Intravenous Immunoglobulin Gamma；IVIG)免疫抑制治疗的器官移植受者，上述方法结果持续阳性，而临床病人病情正常或转好。另外，在临床器官移植中，该类方法结果经常出现假阳性引起对供者选择的误导，致使某些急待器官移植的患者错过移植机会而病情恶化甚至死亡。目前所有测定HLA抗体的方法另一明显不足是所需时间较长，这在尸体供者器官移植中是导致移植失败的首要原因。综上所述，组织交叉配型在器官移植前，对受者体内已经存在的CFAbs测定，是决定器官移植成败的关键因素之一；在器官移植后，是监测受者有无免疫排斥的重要指标；同时，对接受移植后受者的病情转归具有预测作用。目前，国际上普遍使用的上述测定HLA抗体的各种方法，均不能充分满足以上要求。因此，建立一种简便快速、准确、灵敏、特异、稳定的CFAbs测定的标准化方法成为器官移植中的迫切需要。本专利技术根据CDC效应的基本原理，在免疫酶学反应方法学基础上，建立了一种通过测定CFAbs固定补体量实现对CDC效应评估的测量方法。由于CFAbs结合相应细胞HLA抗原和固定补体为CDC效应的最初始阶段，而CFAbs固定补体的量与CDC效应强度(细胞死亡)具有直接正相关关系；因此，测定CFAbs的补体固定量可直接用于CDC效应的评估。同时，本方法在反应系统中引入针对细胞表面特征性抗原的固相抗体，用于识别、分离特定的细胞群，可选择性地在多种细胞混合反应体系中对发生在某种特定细胞群体的CDC效应进行测定。这种CFAbs测定方法摒弃了现存各种HLA抗体测定方法的多种缺陷，具有高灵敏度，高特异性以及经济、简便、快速等独到特点。*相关文献1、Patel R，Terasaki PI.，N Engl J Med 1969；280735-92、Garovoy MR，et al.，Transplant Proc 1983；151939-413、Christiaans MH，et al.，Transplantation 1996；151341-13474、Karuppan ss，et al.，Transplantation 1992；53666-6735、Chia D，et al.，Tissue Antigens 1991；3749-556、(lgA)Koka P.，Transplantation 1993；56207-211*相关专利
技术实现思路
本专利技术根据CDC效应的基本原本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种通过测定补体结合率达到对样品ＣＦＡｂｓ或ＣＤＣ效应测定的免疫学方法及试剂盒。该方法或试剂盒包括以下内容。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈格，
申请(专利权)人：帕弗瑞生物技术北京有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]