本发明专利技术公开了测定食品中苏丹红１号含量的酶联免疫吸附分析方法（ＥＬＩＳＡ），其特点是合成了两种不同碳桥长度的苏丹红衍生物，并将衍生物与载体蛋白质交联，获得四种多克隆抗体。有８种测试组合，７种组合可用于对苏丹红１号的免疫分析，标准曲线的浓度范围为０．１～１００ｎｇ／ｍＬ，ＩＣ↓［５０］为０．３～２．０ｎｇ／ｍＬ。四种抗体与苏丹红２－４号的交叉反应率为０．１～１４．３％，与６种食品可添加色素几乎没有交叉反应，说明抗体对苏丹红１号有很高的特异性。６种市售食品用作加标样品。经简单的样品处理后，萃取液直接稀释，用于ＥＬＩＳＡ测定。苏丹红１号的加标回收率９２．４～１１４％，相对标准偏差为５．９～２４．８％。用ＨＰＬＣ对加标样品进行分析，并与ＥＬＩＳＡ结果对比。两种方法有较高的相关性（Ｒ＝０．９８５１；ｎ＝７）。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种(ELISA)，属于食品安全监督或食品分析的研究领域。
技术介绍
苏丹红是一类人工合成的偶氮类油溶性的化工染色剂，被大量用于机油、汽车蜡和鞋油等工业品，还可以用于烟火礼花的着色。家用的红色地板蜡或红色鞋油通常含有苏丹红1号。随着人们对苏丹红毒性的逐步了解，国际癌症研究机构将苏丹红归为第三类致癌物质，具有潜在的危险。在食品加工过程中，为求制品色彩的艳丽或保持原有的色泽，借以改善食品的感官性状，增进人们的食欲，常常添加一些食用色素。1995年欧盟禁止将苏丹红(尤其是苏丹1号)作为食用色素添加在食品当中，对此我国也明文禁止。但是，由于添加了苏丹红1号的辣椒粉等调味品色泽鲜亮持久，依然有少量食品违规使用苏丹红。2005年2月英国发出食品警告，召回被苏丹红污染的食品。2005年2月23日中国国家质量监测总局发布了关于加强对苏丹红1号食品检验监管的紧急通知，防止含有苏丹红的食品在市场上销售。2005年4月卫生部发布公告，重申不得将苏丹红作为食品添加剂生产、经营和使用。苏丹红的检测方法主要是色谱分析法。欧盟推荐的标准方法(European Commission.NEWS notification03/99Corrected method for the detection of Sudan.2005.)是将含有苏丹红成分的检测物先经过乙腈提取后，过滤，滤液用高效液相色谱(HPLC)分析，以波长可变的紫外-可见光度检测器定性与定量，确证苏丹红可以使用液相色谱-电喷雾离子化质谱联用技术。在我国，国家质检总局发布的国家标准(GB/T 19681-2005)，采用正相吸附和固相萃取原理，一次性去除样品中辣椒色素和番茄色素对食品中苏丹红检测的影响，对苏丹红1-4号进行了HPLC检测。国内、外还报道了一些改良的色谱分析法，如Mazzetti M.等(Food Addit Contam，2004，21935-941)介绍了一种简单而快速的苏丹1号的检测方法；Di Donna L.等(Anal Chem，2004，765104-5108)基于反相液相-串联电喷射质谱技术，建立测定辣椒中苏丹红1-4号的液相-质谱联用检测方法；苏小川等(中国卫生检验杂志，2005(15)1073-1074)探索并建立了气相色谱/质谱技术检测苏丹1号的方法。尽管色谱分析方法较准确，但色谱法仪器昂贵、样品预处理复杂、费时、检测成本高。我国从2005年2月爆发苏丹红事件以来，虽经多次整治，食品”涉红”案件仍时有出现。为了加强食品监督，保障消费者的身体健康，迫切需要建立快速、简便、价廉、灵敏、特异的苏丹红测定新方法。酶联免疫吸附分析方法(ELISA)具有灵敏度高、特异性强、分析快速的优点，ELISA已用于医学临床、药物、食品和环境等分析领域中，但国内外均未见有ELISA测定食品中苏丹红1号含量的文献报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的不足而提供一种，其特点是基于抗原与抗体之间特异性反应而建立的分析方法。本专利技术的目的由以下技术措施实现，其中所述原料份数除特殊说明外均为重量份数。(1)苏丹红1号修饰物的制备1)苏丹红1号-3-丙酸(Sudan 1-C3)的制备将丙二酸0.02～0.08mol溶于20～80mL新蒸吡啶中，加入对硝基肉桂酸0.02～0.1mol及醋酸胺0.001～0.004mol，此混合物在温度100～150℃回流1～7小时，冷却后，将反应物用醋酸重结晶，得到步骤1产物4～10g，熔程275～280℃；将0.15～0.65g步骤1产物，5～35mg钯碳，2～15mL甲醇，加入到反应釜中，通入氢气，于温度100～120℃反应1～5小时，过滤反应物，收集滤液，用旋转蒸发仪旋干滤液，用二氯甲烷∶甲醇＝5∶1的体积比过柱，收集TCL板实验中Rf值为0.3的产物，旋干溶液，得到乳白色固体；将0.1g步骤2产物溶解在1.5～2.5mL的浓盐酸中，在温度5～10℃，加入含0.01～0.06g亚硝酸钠的水溶液0.5mL，搅拌数分钟，得到淡黄色重氮盐溶液，将0.04～0.12g 2-萘酚溶解于8～12％的氢氧化钠溶液3～5mL中，冷却至5℃，再缓慢加入重氮盐溶液中，得到0.12～0.30g Sudan 1-C3，其反应式如下 2)苏丹红1号-4-丁酸(Sudan 1-C4)的制备将0.05-0.4g对氨基苯丁酸溶解在1～4mL浓盐酸中，在冰浴中条件下，加入含0.01～0.06g亚硝酸钠的水溶液0.5mL，搅拌数分钟，得到重氮盐溶液；将0.03～0.11g 2-萘酚溶解于8～12％的氢氧化钠溶液3～5mL中，冷却至5℃，再缓慢加入重氮盐溶液中，得到约0.10～0.40g产品，其反应式如下 (2)免疫原和包被抗原的制备分别称取0.10～0.45mmol的Sudan 1-C3和0.10～0.45mmol Sudan 1-C4，二环己基碳二亚胺0.10～0.80mmol，N-羟基琥珀酰亚胺0.10～0.80mmol，溶解于100～600μL的二甲基甲酰胺中，室温下搅拌过夜，将混合液离心5～20分钟，取上层清液，缓慢加入到0.01～0.02％的牛血清白蛋白(BSA)和0.01～0.02％卵清白蛋白(OV)，搅拌1～10小时，离心分离，取上层清液，透析数天，溶液冷冻干燥，置冰箱中存放，其中，Sudan 1-C3-BSA和Sudan 1-C4-BSA为免疫原；Sudan 1-C3-OV和Sudan 1-C4-OV为包被抗原； (3)苏丹红1号抗体的制备两种免疫原分别免疫两只兔子将1～4mg免疫原溶解于0.5～4mL的生理盐水中，加入0.5～3mL完全福氏佐剂，混合成油包水的乳浊液，每只兔子每次吸取0.5～2.0mL乳浊液，多次皮下注射入兔子背部，1～5周后，对兔进行加强免疫，使用不完全福氏佐剂，其余与第一次免疫相同，第二次免疫后，2～5周进行下一次免疫，并且第三次、第四次免疫后，5～7天抽取0.1～0.5mL耳血，检测抗体产生的情况，第五次免疫后，5～15天处死兔子，取全血，将血液在冰箱中放置过夜，吸取上层清液，分装，于低温冰箱中储存，本专利技术共制得四种抗体C3-I，C3-II，C4-I和C4-II；(4)建立测定苏丹红1号的酶联免疫吸附分析方法(ELISA)对所制得的抗体进行性能表征，在实验条件优化的基础上，建立测定食品中苏丹红1号含量的ELISA；本专利技术的优点1.在国内、外首次成功建立测定食品中苏丹红1号含量的ELISA。2.灵敏度高、特异性强。3.样品处理简单、测试量大、测试费用低。4.对样品的测定，ELISA与HPLC有很好的相关性。附图说明图1.免疫原的紫外-可见光谱图a.Sudan 1-C3-BSA的紫外-可见光谱图b.Sudan 1-C3-BSA的紫外-可见光谱图由图1可知，在280nm(BSA)，320nm和492nm处(Sudan 1号)均有特征吸收，表明苏丹红1号已成功与蛋白交联。图2.苏丹红1号的同类组合的标准曲线包被抗原Sudan 1-C3-OA，1∶30,000(e.g.6.7ng/well)；抗体C3-I，1∶150,000；GaRIgG-HRP，1∶20,000；IC500.64ng/mL.■包被抗原本文档来自技高网...
【技术保护点】
测定食品中苏丹红１号含量的酶联免疫吸附分析方法，其特征在于该方法包括以下步骤： （１）苏丹红１号修饰物的制备 １）苏丹红１号－３－丙酸（Ｓｕｄａｎ １－Ｃ３）的制备 将丙二酸０．０２～０．０８ｍｏｌ溶于２０～８０ｍＬ新蒸吡啶中，加入对硝基肉桂酸０．０２～０．１ｍｏｌ及醋酸胺０．００１～０．００４ｍｏｌ，此混合物在温度１００～１５０℃回流１～７小时，冷却后，将反应物用醋酸重结晶，得到步骤１产物４～１０ｇ，熔程：２７５～２８０℃； 将０．１５～０．６５ｇ步骤１产物，５～３５ｍｇ钯碳，２～１５ｍＬ甲醇，加入到反应釜中，通入氢气，于温度１００～１２０℃反应１～５小时，过滤反应物，收集滤液，用旋转蒸发仪旋干滤液，用二氯甲烷∶甲醇＝５∶１的体积比过柱，收集ＴＣＬ板实验中Ｒｆ值为０．３的产物，旋干溶液，得到乳白色固体； 将０．１ｇ步骤２产物溶解在１．５～２．５ｍＬ的浓盐酸中，在温度５～１０℃，加入含０．０１～０．０６ｇ亚硝酸钠的水溶液０．５ｍＬ，搅拌数分钟，得到淡黄色重氮盐溶液，将０．０４～０．１２ｇ ２－萘酚溶解于８～１２％的氢氧化钠溶液３～５ｍＬ中，冷却至５℃，再缓慢加入重氮盐溶液中，得到０．１２～０．３０ｇ Ｓｕｄａｎ １－Ｃ３，其反应式如下： ＊＊＊ （Ｅ）－３－（４－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）ａｃｒｙｌｉｃ ａｃｉｄ ３－（４－ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ）ｐｒｏｐａｎｏｉｃ ａｃｉｄ ＊＊＊ Ｓｕｄａｎ １－３－ｐｒｏｐａｎｏｉｃ ａｃｉｄ ２）苏丹红１号－４－丁酸（Ｓｕｄａｎ １－Ｃ４）的制备 将０．０５－０．４ｇ对氨基苯丁酸溶解在１～４ｍＬ浓盐酸中，在冰浴中条件下，加入含０．０１～０．０６ｇ亚硝酸钠的水溶液０．５ｍＬ，搅拌数分钟，得到重氮盐溶液；将０．０３～０．１１ｇ ２－萘酚溶解于８～１２％的氢氧化钠溶液３～５ｍＬ中，冷却至５℃，再缓慢加入重氮盐溶液中，得到约０．１０～０．４０ｇ产品，其反应式如下： ＊＊＊ Ｓｕｄａｎ １－４－ｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ （２）免疫原和包被抗原的制备 分别称取０．１０～０．４５ｍｍｏｌ的Ｓｕｄａｎ １－Ｃ３和０．１０～０．４５ｍｍｏｌ Ｓｕｄａｎ １－Ｃ４，二环己基碳二亚胺０．１０～０．８０ｍｍｏｌ，Ｎ－羟基琥珀酰亚胺０．１０～０．８０ｍｍｏｌ，溶解于１００～６００μＬ的...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：邓安平，韩丹，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：90[中国|成都]
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