一种用于测定生物流体样品中ＰＴＸ３蛋白质水平的方法；一种能够产生大鼠抗ＰＴＸ３单克隆抗体的杂交瘤，其中上述的杂交瘤选自ＭＮＢ１０和Ｐｅｎ－３；从杂交瘤ＭＮＢ１０和Ｐｅｎ－３产生的单克隆抗体中筛选得到的特异的抗ＰＴＸ３大鼠单克隆抗体；测定生物流体中ＰＴＸ３蛋白质水平的试剂盒，其中所述试剂盒包含大鼠抗ＰＴＸ３单克隆抗体。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及大鼠抗PTX3单克隆抗体，产生上述抗体的杂交瘤，一种改进的用于测定生物流体中PTX3蛋白质水平的方法和执行上述测定方法的试剂盒。更具体而言，上述方法、上述大鼠抗PTX3的单克隆抗体和上述试剂盒可用于早期诊断患有心血管和/或脑血管疾病的人类个体的死亡风险。五聚环蛋白(pentraxins)，因其五聚结构而得名，是一群包括C反应性蛋白质(CRP)和血清淀粉状蛋白P(SAP)的蛋白质，由肝脏对炎症介质的反应而产生。其血清中的水平会因不同的刺激反应而升高，且已经被用于监测感染、炎症状况和组织损坏。PTX3是此类家族中的一个新成员，发现于由白细胞介素-1(IL-1)刺激的内皮细胞中。PTX3为一类典型的长链五聚环蛋白，含有一个与经典五聚环蛋白同源的203个氨基酸的C端区域，和一个缺乏同源性的178个氨基酸的N端区域。与CRP和SAP相反，PTX3可产生于各种类型的细胞中，主要是在内皮细胞和单核吞噬细胞中；它应激于IL-1和肿瘤坏死因子(TNF)而产生，但不能应激于IL-6而产生。另外，PTX3由单核细胞应激于分枝杆菌细胞壁组分以及由类风湿性关节炎病人的非刺激滑膜细胞产生。早在1992年就已经鉴定了PTX3蛋白质(Breviario F等人，″Cloning of a new gene related to C-reactive protein and serumamyloid P component″J.Biol.Chem.1992，26722190-22197)。众所周知的是，它在细菌中的生产见如Vidal Alles V.等人″Inducible expression of PTX3，a new member of the pentraxinfamily，in human mononuclear phagocytes.″Blood 1994，843483-3493中所描述，而它在真核细胞(CHO)中的生产已经由BottazziB.等人″Multimer formation and ligand recognition by the longpentraxin PTX3-Similarities and differences with the shortpentraxin C-reactive protein and serum amyloid component.″J.Biol.Chem.1997，27232817-32823中所描述。然而，尚未完全清楚PTX3蛋白质的生物学功能。新近的研究已经阐明，在患有急性或慢性炎症性疾病如脓毒症或心肌梗塞的病人中PTX3蛋白质的水平会上升。具体而言，Peri等人已经报道了在心肌梗塞病人进入医院冠心病监护室7.5小时后，其PTX3蛋白质水平达到峰值，为6.94±11.26ng/ml(Circulation 2000，102636-641)。更近期一些，人们观测到心肌梗塞病人中的PTX3蛋白质水平能预示该时期后三个月内的死亡风险(Latini R.等人，″Prognosticsignificance of the long pentraxin PTX3 in acute myocardialinfarctioncomparison with C-reactive protein，NT-proBNP andtroponin T.″abstract 3091，Supplement IV，page 680，Circulation 2003，108(17).)。更具体而言，该文作者报道了代表性数量的患有心肌梗塞和ST段升高的病人，其急性阶段的PTX3蛋白质水平提供了能预示死亡风险的独立信息。基于C-反应性蛋白质(短链的五聚环蛋白)或其它的生物心脏标记分子(如NT-proBNP或肌钙蛋白-T)的水平则不能做出同样的预测。更进一步，这些专利技术者意识到，脑中风病人的实验数据显示，PTX3蛋白质的水平与中枢神经系统所受的损害成比例。文献中报道的PTX3的测定，是采用了一种ELISA方法，其基于特异针对PTX3蛋白质的单克隆抗体和生物素标记的特异针对PTX3蛋白质的多克隆兔IgG。上述的单克隆抗体在文献中鉴定为MNB4，但公众不能得到与之相应的杂交瘤。具体而言，上述的方法在Muller B等人loc.cit.的论文中已经描述，并包含以下步骤a)在96-孔ELISA平板(丹麦Nunc Roskilde公司)用100μl的大鼠单克隆抗体NMB4(腹水，在缓冲液中按1∶5000稀释用作包被)包被，并在4℃孵育过夜；b)然后用含有0.05％Tween20的Dulbecco磷酸缓冲盐(清洗缓冲液)和200μl 5％奶粉完全清洗该平板，封闭非特异性结合位点；c)在环境温度下孵育2小时后，再用清洗缓冲液清洗该平板3次；d)在RPMI 1640培养基(Seromed，Berlin，Germany)和2％牛血清白蛋白(Sigma Chemicals，St.Louis，MO)中稀释的50μl标准重组人PTX3(从100pg/ml到10ng/ml)，或测试血浆样品，放置于每个孔中(一式三份)，再将平板在37℃孵育2小时；e)将平板用清洗缓冲液清洗3次，加入100μl在清洗缓冲液中1∶2000稀释的与生物素缀合的抗TPX3兔血清；f)将平板在37℃温育1小时，然后用200μl清洗缓冲液清洗3次；g)在每个孔中加入100μl 1∶4000稀释的与葡聚糖(Amdex，Copenhagen，Denmark)缀合的链霉亲和素-过氧化物酶，将平板在环境温度下孵育1小时；h)将平板清洗4次之后，加入100μl生色底物ABTS MicrowellPeroxidase Substrate System(Kirkegaard and Perry Laboratories，Gaithersburg，MD)；i)用自动读数器在405nm为平板读数。本专利技术者已经观察到上述众所周知的方法中存在很多的缺点。已知方法的第一个缺点包含下列在一些病人的血浆中，不同稀释倍数的测试血浆样品下测定的PTX3水平与实施的稀释倍数不成比例。本专利技术者已经发现，令人惊讶的是，向测试血浆样品中添加EDTA可以克服这个缺点。尽管该发现的原理还没有完全阐明，本专利技术者假定(但并不希望限制本专利技术的范围)，观察到的效果是因为EDTA有结合Mg2+和Ca2+的能力，因而使用其它配位试剂可以获得相同的结果。第二个缺点包含下列在大约5％的正常受试者中，已知方法的灵敏度(大约200pg/ml)不足以测定PTX3蛋白质。本专利技术者已经发现，通过使用新的单克隆抗体(步骤a)、改变链霉亲和素-过氧化物酶的浓度(步骤g)和使用不同的色原(步骤h)，该方法的灵敏度可以提高至75pg/ml。其中的一个方面，本专利技术涉及一种在生物流体中测定PTX3蛋白质水平的方法，包含以下步骤i)将96-孔ELISA平板用100μl含有大鼠单克隆抗体的溶液包被，并在4℃温育一夜；ii)然后将该平板用缓冲溶液和能够封闭非特异性结合位点的溶液进行清洗；iii)在环境温度下温育2小时后，将该平板再度用清洗缓冲液清洗；iv)将稀释于合适培养基中的50μl标准重组人PTX3或待测生物流体样本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种测定生物流体样品中的ＰＴＸ３蛋白质水平的方法，包含以下步骤： ｉ）将９６－孔ＥＬＩＳＡ平板用１００μｌ含有大鼠单克隆抗体的溶液包被，并在４℃温育一夜； ｉｉ）然后将该平板用缓冲溶液和能够封闭非特异性结合位点的溶液进行清洗； ｉｉｉ）在环境温度下温育２小时后，将该平板再度用清洗缓冲液清洗； ｉｖ）将稀释于合适培养基中的５０μｌ标准重组人ＰＴＸ３或待测生物流体样品加入到每个孔中，一式两份，并将该平板在３７℃温育２小时； ｖ）将平板用清洗缓冲液反复清洗，然后再将１００μｌ的２５ｎｇ／ｍｌ生物素化抗ＰＴＸ３兔ＩｇＧ的清洗缓冲液加入到每个孔中； ｖｉ）将平板在３７℃温育１小时，然后用清洗缓冲液反复清洗； ｖｉｉ）在每个孔中加入１００μｌ稀释的链霉亲和素－过氧化物酶，并将平板在环境温度下温育１小时； ｖｉｉｉ）将平板用清洗缓冲液反复清洗后，在每个孔中加入１００μｌ的生色底物； ｉｘ）将平板在环境温度下短暂温育，加入终止溶液，并使用自动读数器在４０５ｎｍ为平板读数； 其中的改进之处在于： －－在步骤（ｉ）中使用的大鼠单克隆抗体是从杂交瘤ＭＮＢ１０（登录号Ｎｏ．ＡＢＣ／ＰＤ０４００１）或杂交瘤Ｐｅｎ－３（登录号Ｎｏ．ＡＢＣ／ＰＤ０１００４）中获得的抗体； －－在步骤（ｖｉｉ）中使用的链霉亲和素－过氧化物酶以１∶８０００稀释；并且 －－在步骤（ｖｉｉｉ）中使用的生色底物是四甲基联苯胺（ＴＭＢ）。...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：A曼托瓦尼，G佩里，
申请(专利权)人：法玛发展有限公司，
类型：发明
国别省市：IT[意大利]
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