一种抗肿瘤蛋白质制造技术

本发明专利技术公开了一种抗肿瘤蛋白质，所述的蛋白质其氨基酸序列见序列表SEQ ID NO6，所述蛋白质的核苷酸序列见序列表SEQ ID NO5。本发明专利技术还公开所述蛋白质对肿瘤细胞杀伤的实验。本发所述的蛋白质分子量较小，对肿瘤细胞的杀伤效果好。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及ー种蛋白质。具体而言，本专利技术涉及一种能够抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞的凋亡的蛋白质。
技术介绍
血小板来源生长因子受体样基因(F1DGFRL Platelet-derived growth factorreceptor-like)位于8p21.3_p22,基因全长1128bp,是近些年新发现的抑癌基因，该基因约600kb，人鼠同源，相似性达90%。在结肠癌、乳腺癌、肺癌、肝癌病人的肿瘤组织中特异性低表达。研究表明，Susanne Seitz等人通过免疫组化等大量数据证实I3DGFRL在乳腺癌的发生发展中起主要影响。其表达的·蛋白全称F1DGFRL protein (Platelet-derived growthfactor receptor-like protein),共 375 个氨基酸。PDGFRL 因其与]3DGFR beta 的胞夕卜结构域有显著相似性，故起名为I3DGFR-样蛋白，且被证实作为肿瘤抑制基因(TSGTumorSuppressor Gene)參与I3DGF信号通路，对其产生对抗作用影响TOGF和其受体的相互作用。少数学者认为TOGFRL之所以能作为TSG，是因为TOGFRL在非小细胞肺癌、肝癌及前列腺中具有高频率的接近杂合性缺失的基因，帮助其错义修复的功能。有研究报道，重组人TOGFRL蛋白能有效抑制结肠癌细胞系HCT-116的増殖和迁移。由于TOGFRL蛋白具有抑制肿瘤细胞的作用，但其分子量较大，不便于蛋白药物的投递，且具有较强的免疫原性。为解决其分子量大带来的不便，本专利技术通过对TOGFRLprotein蛋白序列进行分析、筛选、优化得到不仅分子量小，而且具备比TOGFRL全长蛋白更高的肿瘤细胞杀伤活性的多肽。
技术实现思路
为解决TOGFRL蛋白分子量大带来的不便，本专利技术通过以下方案解决所述的技术问题。本专利技术的所设计筛选的活性区域蛋白D2分子量远小于TOGFRL蛋白分子量，而且其对肿瘤细胞的杀伤效果好于TOGFRL蛋白，所述活性区域蛋白D2的氨基酸序列见序列表SEQ ID N06，所述活性区域·蛋白D2的核苷酸序列见序列表SEQ ID N05，扩增活性区域蛋白基因⑶2的上下游引物其序列分别为SEQ ID N03和SEQ ID N04。一种制备活性区域蛋白D2的方法，包括以下步骤:I)根据TOGFRL基因序列分析其蛋白活性区域，并设计引物，所述引物的序列见序列表SEQ ID N03和SEQ ID N04,通过PCR方法扩增目的基因片段，将扩增的目的片段连接到载体上，得到的重组质粒转化到克隆细胞中，提取重组质粒并测序；2)将测序正确含有目的基因的表达载体转化到相应的表达细胞中，诱导表达目的蛋白，获得TOGFRL全长蛋白及其活性区域蛋白，制备蛋白样品，测蛋白浓度；3)将上ー步所得的蛋白通过SDS-PAGE及Western Blot鉴定,检测所得蛋白是否表达成功。上述方法中所述的载体可以为原核细胞表达载体、真核细胞表达载体或昆虫细胞表达载体，所述载体优选Pet28a(+);所述的表达细胞可以为原核表达细胞、真核表达细胞或昆虫细胞，所述表达细胞优选E.coli BL21(DE3)。本专利技术通过以下实验检测TOGFRL蛋白及其活性区域蛋白对肿瘤细胞的影响:通过SRB法检测TOGFRL蛋白及其活性区域蛋白对肿瘤细胞增殖抑制的效果。所述的SRB法是一种检测细胞增殖情况的方法其原理是，SRB即磺酰罗丹明B(SulforhodamineB，SRB)是一种粉红色阴离子染料，易溶于水，在酸性条件下可特异性地与细胞内组成蛋白质的碱性氨基酸结合；在540nm波长下产生吸收峰，吸光值与细胞量成线性正相关，故可用作细胞数的定量检测。本专利技术所述的TOGFRL蛋白及其活性区域蛋白对结肿瘤细胞增殖的抑制随着蛋白浓度的升其抑制效果逐渐升高。结果显示本专利技术设计的TOGFRL活性区域蛋白D2对细胞的抑制比TOGFRL全长蛋白明显，而且D2蛋白的抑制效应最显著。BSA和空载蛋白作为阴性对照，对细胞无明显抑制作用。通过流式细胞仪检测TOGFRL蛋白及其活性区域蛋白D2对结肠癌细胞细胞周期影响，结果表明:H)GFRL蛋白及活性区域蛋白D2均能将CT-26细胞周期阻滞于G2/M期，其中本专利技术设计筛选的活性区域蛋白D2效果最为显著。通过流式细胞仪检测TOGFRL蛋白及其活性区域蛋白D2能否诱导结肠癌细胞凋亡，结果显示TDGFRL蛋白及其活性区域蛋白D2均能诱导CT-26细胞凋亡，且随着刺激时间的延长，CT-26凋亡更加明显。与上述细胞周期的检测结果相一致，活性区域蛋白D2的促凋亡效应更为显著。本专利技术的另一个目的是提供本专利技术的活性区域蛋白D2在制备抗肿瘤药物中的应用，即以本专利技术的D2蛋白为活性成分的抗肿瘤药物，特别是治疗结肠癌、乳腺癌、肺癌、肝 癌。在需要的时候，在上述药物中还可以含有一种和多种药学可接受的载体，所述的载体包括药学领域常见的稀释剂、赋形剂、填充剂、崩解剂等。附图说明图1.A =PDGFRL全长蛋白考马斯亮蓝染色示意图和Western blotting检测图，B:活性区域蛋白D2考马斯亮蓝染色示意图和Western blotting检测图；图2.SRB法检测四种蛋白对CT-26细胞的增殖抑制，总:H)GFRL总蛋白；D2:活性区域蛋白D2 ；BSA:牛血清白蛋白；PET:pet28a(+)空载蛋白P < 0.05 ;图3.PDGFRL总蛋白及活性区域蛋白D2刺激CT-26系细胞后PI染色经流式细胞仪检测图；通路:FL2-A ；图4.A PDGFRL总蛋白及活性区域蛋白D2刺激CT-26系细胞16h后凋亡检测图；通路:FITC和PI ;图48未加蛋白组及空载、BSA蛋白刺激CT-26系细胞24h后凋亡检测图；通路:FITC和PI ;图4CPDGFRL总蛋白及活性区域蛋白D2刺激CT-26系细胞24h后凋亡检测图；通路=FITC和PI。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进ー步阐述，但绝不局限于实施例所述的范围。下面实施例中未表明具体条件的试验方法，通常按照常规的条件。实施例1TOGFRL蛋白及活性区域基因的提取1.实验材料表达菌株E.coli BL2KDE3)购于原平皓生物技术有限公司；目的基因由英骏生物制剂公司合成的构建于PMD18-T vector (Takara)的质粒(含目的片段)，表达载体pET28a(+)质粒载体为本室保存。琼脂糖亲和介质镍柱(Ni)购于国家生化工程技术研究中心(北京)；His-Taq标签抗体购自天津三箭生物技术有限公司(货号:KM8001)，其他试剂均为进ロ或国产分析纯。DNA测序由北京天ー辉远生物科技有限公司完成。小鼠结肠癌细胞系CT-26购自美国ATCC公司。2.设计引物调取I3DGFRL基因首先设计引物获取小鼠I3DGFRL蛋白的基因全序列，引物如下:SEQ ID NOl:TTCCATGGCATTCTCCTAAGAAC ；SEQ ID N02:MCTCGAGGGAMACTCAACAGT，其中 CCATGG 为 SEQ IDNOl的酶切位点；CTCGAG为SEQ ID N02的酶切位点；划横线为保护碱基。通过PCR扩增获得小鼠I3DGFRL的基因序列长度为本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗肿瘤蛋白质，其特征在于，所述的蛋白质其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：6所示。

【技术特征摘要】
1.一种抗肿瘤蛋白质，其特征在于，所述的蛋白质其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:6所示。2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于，所述的蛋白质其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:5 所示。3.一种扩增权利要求2所述蛋白质核苷酸序列的引物，其特征在于，所述引物包括上游引物和下游引物，其序列如序列表SEQ ID NO:3和SEQ ID N0:4所示。4.一种制备权利要求1或2所述蛋白质的方法，包括以下步骤: 1)根据TOGFRL基因序列分析其蛋白活性区域，并设计引物，所述引物的序列如序列表SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示，通过PCR方法扩增目的基因片段，将扩增的目的片段连接到载体上，得到的重组质粒转化到克隆细胞中，提取重组质粒并测序，同时扩增I3DGFRL全长...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈国江，韩根成，王仁喜，肖鹤，侯春梅，黎燕，冯建男，沈倍奋，王一，王柯，刘桂君，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11