基于杂交瘤技术和高通量测序的抗体发现方法技术

本发明专利技术公开了一种产生结合至少一种靶抗原的重组抗体的方法，以及由其产生的重组抗体。本发明专利技术的产生抗体的方法将优化的高通量抗体测序方法和杂交瘤抗体筛选技术相结合，与传统的杂交瘤单克隆抗体技术相比，扩大了候选抗体基因的选择范围，提高了抗体结构优化的效率，增加了获取功能性抗体的可能性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医药
，具体地，涉及一种基于杂交瘤技术和高通量测序产生结合至少一种靶抗原的重组抗体的方法，以及由该方法所获得的重组抗体。
技术介绍
杂交瘤技术是最常用的抗体挖掘技术，但是其步骤繁琐，并且得到单克隆细胞所需要的亚克隆过程耗时长、成本高。近年来，高通量测序技术越来越多地应用于免疫抗体可变区基因谱的表征分析，以及抗原特异性抗体的发现。该方法通过对免疫前、后免疫球蛋白基因的高通量测序，获得免疫动物的抗体可变区基因谱。在免疫后显著富集的抗体基因被认为可能与特异性抗原相关，选取抗体可变区基因谱中的高丰度的重链和轻链基因在体外配对重组表达抗体。相比较抗体基因随机配对表达，采用高丰度基因配对可以提高产生功能抗体的效率，减少配对的盲目性。此外，还可产生大量的候选序列用于抗体配对表达和功能验证，扩展功能抗体筛选池的规模。相对于传统的杂交瘤以及噬菌体展示技术，该技术规避这两种技术的局限性，包括仅适用于鼠和兔等有限的物种，原核表达系统中的密码子选择，后续需要进行人源化等技术难点。同时，抗体组测序方法可以加速获取杂交瘤抗体基因的进程。无需得到最终的单克隆，在寡克隆阶段即可收集并测序；非单克隆序列由二代测序结果进行校正。相比于传统的一代测序检测单/寡克隆抗体信息，可以通过PCR添加细胞index序列后，混合用二代测序进行杂交瘤抗体基因测序，提高通量，降低成本。然而，此技术的缺陷在于：1)无法获取天然抗体配对信息；2)单纯依靠基因丰度配对导致基因配对方法单一，配对成功率低，后续基因合成和配对筛选工作量大。近年来，通过蛋白质组技术分析抗体可变区多肽的丰度，结合高通量测序获取抗体基因的序列的方法，已经应用于抗体生产。采用特异性标记分离抗体生产细胞，通过高通量单细胞抗体测序技术可以获得天然重链和轻链配对信息。但是单细胞抗体测序和蛋白质组分析对于生物信息分析方法与实验条件都有很高的要求，这无疑增加了抗体发掘的难度。此外，抗体可变区基因谱的获取也存在一些技术难度。抗体序列特异性引物的覆盖度和引物扩增效率不一，导致抗体可变区基因谱缺失抗体基因信息或者信息存在偏向性，获得的高丰度序列不具备抗原特异性；RACE方法建库可以克服偏向性，但是扩增片段较长难以测通，有可能缺失部分抗体序列信息。
技术实现思路
针对现有杂交瘤技术耗时长，抗体细胞系筛选范围小，难以获取高亲和力单克隆抗体的缺陷，以及抗体测序技术存在的建库偏向性以及配对盲目性等缺陷，本专利技术将优化的高通量抗体测序方法和杂交瘤抗体筛选技术相结合，与传统的杂交瘤单克隆抗体技术相比，扩大了候选抗体基因的选择范围，提高了抗体结构优化的效率，增加了获取功能性抗体的可能性。本专利技术通过以下技术方案实现上述目的：第一方面，本专利技术提供了产生结合至少一种靶抗原的重组抗体的方法，其包括：(1)用所述至少一种靶抗原免疫宿主受试者；(2)使用经免疫的宿主受试者的脾脏细胞，制备杂交瘤细胞系，并获取特异性结合所述至少一种靶抗原的杂交瘤抗体基因信息；(3)使用免疫后的宿主受试者的淋巴细胞，进行免疫球蛋白基因可变区的高通量测序，获取针对所述至少一种靶抗原的抗体可变区基因谱；(4)选取杂交瘤抗体重链基因作为第一候选配对基因，并与从抗体可变区基因谱中选择的轻链基因作为第二候选配对基因进行配对，以产生候选重组抗体。在具体实施方案中，步骤(2)中，所制备的杂交瘤细胞系能够产生与所述靶抗原具有高亲和力的单克隆抗体，优选为与靶抗原的结合常数不高于10-9M的单克隆抗体。在优选的实施方案中，所述杂交瘤抗体基因信息包含抗体的重链和轻链可变区基因信息。在优选的实施方案中，通过以下获取杂交瘤抗体基因信息：以杂交瘤细胞总mRNA为模板，Oligo dT为引物，经反转录合成cDNA第一链，再以cDNA第一链为模板，以混合的特异性引物扩增抗体重链可变区和轻链可变区基因，测序分析得到杂交瘤基因序列，将杂交瘤基因序列进行IgBlast分析，排除来源于构成杂交瘤的融合伴侣瘤自身的抗体基因和无义基因，得到候选重链和轻链可变区基因。在优选的实施方案中，步骤(3)中，所述抗体可变区基因谱包含抗体的重链和轻链可变区基因信息；优选地，所述基因信息是通过高通量DNA测序确定的；进一步优选地，所述高通量DNA测序包括在测序反应的同时进行合成、连接或者杂交；以及单分子DNA测序、多聚合酶群落测序、纳米孔测序或其组合；进一步优选地，所述高通量测序通过以下实施：以细胞总mRNA为模板，使用SMARTer RACE技术合成第一链cDNA；设计上游引物，并根据抗体恒定区序列保守区设计下游引物，以扩增抗体序列可变区。在优选的实施方案中，步骤(4)中，从抗体可变区基因谱中选取包含高丰度CDR3或者包含与所述高丰度CDR3高度相似的CDR3的轻链基因作为第二候选配对基因。专利技术人发现，具有高相似度CDR3的轻链基因可以与同一条重链基因配对产生功能抗体。在优选的实施方案中，在从抗体可变区基因谱中选定第二候选配对基因的CDR3 的情况下，通过以下方法获得第二候选配对基因的抗体可变区：从包含所选定CDR3的抗体基因片段的测序结果中，依次选取最高丰度的CDR2和CDR1片段信息，然后挑选最高丰度的包含选定CDR2和CDR1片段信息的可变区全长序列，作为第二候选配对基因的抗体可变区序列。在优选的实施方案中，所述方法还包括用所述至少一种靶抗原对所得抗体进行鉴定的步骤，由此产生结合所述至少一种靶抗原的重组抗体。在具体实施方案中，所述鉴定步骤包括体外表达所得抗体的scFv或Fab片段或IgG，将所得scFv、Fab片段或IgG与靶抗原进行结合力测试；优选地，所述体外表达方法包含但是不限于：通过原核细胞、噬菌体展示方法或酵母系统表达scFv或者Fab片段，或者通过哺乳细胞外源基因表达Fab或者IgG；优选地，所述测试方法包括但不限于ELISA和/或SPR。在本专利技术的上下文中，术语“高亲和力”是指抗体亲和力常数不高于10-9M。在本专利技术的上下文中，术语“高丰度”是指在抗体可变区基因谱中的丰度高于1％。在本专利技术的上下文中，术语“高度相似”是指在氨基酸水平上与待比较的对象具有高于80％的序列同一性。第二方面，本专利技术提供了一种根据上述第一方面所述的方法制得的重组抗体。在本专利技术的一个具体实施方案中，专利技术人获得了特异性靶向HA的功能性重组抗体，所述重组抗体的重链可变区包括如SEQ ID NO:40，42和50所示的CDR3，并且所述重组抗体的轻链可变区包括如SEQ ID NO:20，53，68和103所示的CDR3。在本专利技术的另一个具体实施方案中，专利技术人获得了特异性靶向PD-L1的功能性重组抗体，所述重组抗体的重链可变区包括如SEQ ID NO:84所示的CDR3，并且所述重组抗体的轻链可变区包括如SEQ ID NO:23，89和105所示的CDR3。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术结合杂交瘤技术与抗体测序技术，通过特定的选择方式，将从杂交瘤中获取的抗体重链基因和抗体可变区基因谱中获取的轻链基因配对表达，获取功能性抗体。所采用的优化的抗体文库制备流程，可以完整地获取免疫受试者的抗体可变区基因谱，实验结果具有很高的重复性；所采用的优化的生物信息学分析方法可以快速地获取CDR本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种产生结合至少一种靶抗原的重组抗体的方法，其包括：(1)用所述至少一种靶抗原免疫宿主受试者；(2)使用经免疫的宿主受试者的脾脏细胞，制备杂交瘤细胞系，并获取特异性结合所述至少一种靶抗原的杂交瘤抗体基因信息；(3)使用免疫后的宿主受试者的淋巴细胞，进行免疫球蛋白基因可变区的高通量测序，获取针对所述至少一种靶抗原的抗体可变区基因谱；(4)选取杂交瘤抗体重链基因作为第一候选配对基因，并与从抗体可变区基因谱中选择的轻链基因作为第二候选配对基因进行配对，以产生候选重组抗体。

【技术特征摘要】
1.一种产生结合至少一种靶抗原的重组抗体的方法，其包括：(1)用所述至少一种靶抗原免疫宿主受试者；(2)使用经免疫的宿主受试者的脾脏细胞，制备杂交瘤细胞系，并获取特异性结合所述至少一种靶抗原的杂交瘤抗体基因信息；(3)使用免疫后的宿主受试者的淋巴细胞，进行免疫球蛋白基因可变区的高通量测序，获取针对所述至少一种靶抗原的抗体可变区基因谱；(4)选取杂交瘤抗体重链基因作为第一候选配对基因，并与从抗体可变区基因谱中选择的轻链基因作为第二候选配对基因进行配对，以产生候选重组抗体。2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(2)中，所制备的杂交瘤细胞系产生与所述靶抗原具有高亲和力的单克隆抗体；优选地，所述杂交瘤抗体基因信息包含抗体的重链和轻链可变区基因信息；优选地，通过以下获取杂交瘤抗体基因信息：以杂交瘤细胞总mRNA为模板，Oligo dT为引物，经反转录合成cDNA第一链，再以cDNA第一链为模板，以混合的特异性引物扩增抗体重链可变区和轻链可变区基因，测序分析得到杂交瘤基因序列，将杂交瘤基因序列进行IgBlast分析，排除来源于构成杂交瘤的融合伴侣瘤自身的抗体基因和无义基因，得到候选重链和轻链可变区基因。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，步骤(3)中，所述抗体可变区基因谱包含抗体的重链和轻链可变区基因信息；优选地，所述基因信息是通过高通量DNA测序确定的；进一步优选地，所述高通量DNA测序包括在测序反应的同时进行合成、连接或者杂交；以及单分子DNA测序、多聚合酶群落测序、纳米孔测序或其组合；优选地，所述高通量测序通过以下实施：以细胞总mRNA为模板，使用SMARTer RACE技术合成第一链cDNA；设计上游引物，并根据抗体恒定区序列保守区设计下游引物，以扩增抗体序列可变区。4.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈维之，王晓红，洪媛媛，陈豫，孙中平，
申请(专利权)人：苏州金唯智生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32