检定方法技术

本发明专利技术涉及确定血液中针对免疫原的抗体的数量或存在的方法，包含至少以下步骤：在所述样本中检测血浆抗体或其部分以及淋巴细胞抗体或其部分的数量或存在，其中所述血浆和淋巴细胞抗体一起或在单独的检定中检测，以及它们的综合的数量或存在的确定确定了针对所述免疫原的抗体的数量或存在。也提供了该方法在高吞吐量筛查、血库样本筛查和诊断中的应用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术属于抗体检定领域，具体涉及利用简单方法检测血液样品中经诸如感染或接种等之类的抗原激发而产生的抗体，所述简单方法包括在同一血液样品中确定淋巴细胞和血浆抗体存在。优选的是，以单一同时估定血浆和淋巴细胞抗体。
技术介绍
存在几种可利用来检测样品中抗体水平的技术，例如ELISA检验。最常见的情况是，将ELISA用作血清学检定，但是它也可用于研究抗原或抗体的免疫化学特性，还经常用于，例如，免疫反应的评估及定性，另外还可在杂交瘤技术中用于通过细胞培养研究抗体的产生。ELISA检定使用简单，敏感且相对快速，但是它仅仅能够对样品中分泌的靶抗体的存在进行检定；它无法将应答抗原而即时合成的抗体合成与感染或被动转移后业已存在的抗体区分开来。只有已经从淋巴细胞中分泌的抗体被检测到。该技术没有检测到没有分泌的淋巴细胞抗体。除了ELISA检验之外，已经使用ELISPOT或酶联免疫斑点检定，综述参见，例如，Czerkinsky等，ELISA中及其它固相免疫检定(in ELISA and other Solid phase Immunoassays)，Eds.D.M.Kenneny和S.J.Challacombe编著，1988，第10章，217-239。该技术以ELISA方法为基础，可对分泌抗一种或多种靶抗原之抗体的淋巴细胞计数。所述ELISPOT基本上是ELISA方法的一种变体，因而可以通过以下方法来揭示抗体分泌细胞(ASC)，即在用靶抗原包被过的经专门改进的ELISA孔中培养淋巴细胞，用酶-底物复合物代替标准ELISA试剂，该酶-底物复合物可在分泌细胞近处生成显色沉淀(斑点)。然后可通过斑点计数来测算出抗体生成细胞的数目。可在培养基中加入蛋白质合成抑制剂，以确保所检测到的斑点是由体外孵育期间的抗体从头合成途径生成的。尽管ELISPOT技术在研究体液免疫应答动力学中非常有用，并可用于检测经免疫受试者外周循环中瞬时出现的自发ASC，但该方法的某些特性限制了它在临床诊断中的应用。首先，由于每个样品的斑点都须单个测量，耗时且费力，该方法尤其不适用于大量样品的分析，例如临床诊断试验室中的操作。其次，只检定每个样品中的抗体分泌细胞的数目，一般来说，这理论上讲需要相当大量样品体积，例如，几毫升。另外ELISPOT检定板也很昂贵，而且该检定不易自动化。最近，开发了检测即时抗体合成的检定。在此通过参考被结合的WO 96/26443描述了这样的一种检验。在该检定中，分离淋巴细胞然后进行培养，检定该培养过程中生成的和从淋巴细胞分泌的抗体水平。因此，为了能对孵育过程中分泌的抗体进行检定，该技术需要在约37℃下孵育测试样品的淋巴细胞。平均孵育时间为2-5小时，这就极大地限制了该检定的操作速度。另外孵育还需要在测试位点提供适当的装置，以便其能在检定步骤前立即执行。这通常意味着淋巴细胞的检定必须在样品离体后很短的时间内执行，因为不可以通过例如冷冻贮存样品，这会导致细胞活力的下降。通过在0℃的冰上储存或稍差一点在4℃保存纯化后的细胞，也只能在相当短的时间内保持活力。在此通过参考被结合的WO00/77525描述了另一种抗体检定。该检定被专门设计检测在其分泌之前包含抗体的淋巴细胞。在该检定中，样品的淋巴细胞被溶解，进而检测到通过该溶解从淋巴细胞中释放的抗体。这个检定基于以下发现，即淋巴细胞裂解可产生足够数量的“新合成的抗体”，以允许用于免疫诊断目的的检测。便利地，以这种方法，在溶解之前纯化样品中的淋巴细胞。因此，WO00/77525中所述的不要求用于检测目的的足够抗体合成的体外孵育样品，而这是使用标准抗体检测检定的情况，该标准抗体检测检定检测在体外或体内分泌的抗体。因此，该检定具体用于检测在诸如感性或防染处理的激发之后较短时期内的急性感染，此时应答该激发而淋巴细胞快速产生抗体。然而，WO00/77525中所述的方法仅仅允许活性抗体产生出现时的感染检测，也就是在激发之后的短时期期间。这个窗口对应于细胞处于正在产生可检测的抗体水平的时限。在激发后，B淋巴细胞开始合成抗体且应答抗原激发而分割。在该时期中，通常感染3到10天，淋巴细胞快速合成感兴趣的抗体，且因此这些细胞中的抗体水平为高的。然而，这些细胞是短命的，结果是，在感染后大约两周，由淋巴细胞产生的相关抗体的数量明显下降。距离感染近似两周，存在于溶解的淋巴细胞中的相关抗体的数量回归到低水平。例如，这被示出在WO00/77525中所示的流行性感冒研究中。因此，这种方法，尽管对检测急性感染非常有用，但是不能检测即时感染或感染之后，因此仅仅用于诸如感染或防染处理的激发之后相当短时限。能够理解的是，需要允许对来自病人的样品中的感染进行快速且准确检测的方法，并且该方法具有对感染的早期检测相关联的明显优点。尽管存在允许对急性感染的检测技术(例如WO00/77525)和允许对感染后或即时感染的检测技术，但是不存在单一的测试，即能够对个体在其生命期中某些点处是否暴露于特定激发(例如感染，也就是具有极性的、即时的(慢性)感染或感染后)的问题提供一种快速反应。因此，在不需要了解激发时间的情况下，能够识别激发是否已经发生应该是及其有价值的。然后，同样测试可被用于不管激发时间的样品分析，例如用于慢性和急性感染。目前没有单一测试符合这些需要。这种测试在高吞吐量筛查(high-throughput screening)中将尤其有用，在该高吞吐量筛查中需要关于源有机体的感染状态的信息。例如，血库需要快速和准确的测试来确定将被用于输血的血液的安全。这在高流行血液传染病的世界区域内尤其重要，诸如HIV(艾滋病)和肝炎，其可被传递给血液受体。检测HIV感染的目前方法和对经输血而HIV传播的风险的控制在某些地区是现场的。例如，在南非已经执行血液安全政策，以及高感染风险的个人接受调查问卷、供体训练和一对一访问便于其处理。这种规定和自我排除均有助于明显降低这群人的血清阳性率。这与普通人口中HIV/AIDS广泛流行的逐步扩大形成对比。预期的血液供体中的高HIV血清阳性率在传染力的免疫静止“窗口期限”中增加了HIV传播的风险。在1994年，在南非，估计这种风险在该窗口期限中为每100,000供体中2.2个感染者(Sitas F等的S.Afr.Med.J.1994；84142-144)。在免疫静止窗口期限期间，使用已知的商业化的可利用的检定不可能检测到HIV感染。如使用标准数学模型所估计的，对构造的风险管理计划的执行将对血液制品的受体的风险降低至100,000供体中的大约1个。这种实测的风险大约降低四倍，但是这可能是由于难于实现对输血传递的疾病诊断的因素。目前存在可利用的某些HIV检验。例如，使用发展中国家研究所显示的对HIVI p24抗原检验的引入，以缩短免疫静止窗口期限。P24检定检测感染后15-18天的感染(图1)。已经被考虑的是，用以检测单个供体中的血浆衍生的病毒核酸的更敏感的检验，可能是最有效率的方法，以更进一步减少传染性的窗口。这使用核酸检验(NAT)是可能的，但是这种技术具有污染、训练、实验室空间、质量保证和显著的成本的后勤问题。这些因素限制了将NAT引入更流行地区的一些中心区(Busch M.P.Chapter 2；Bl本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种确定血液样本中对于免疫原的抗体的数量或存在的方法，至少包含以下步骤：在所述样本中检测血浆抗体或其部分以及淋巴细胞抗体或其部分的数量或存在，其中所述血浆和淋巴细胞抗体被一起或在分开的检定中被检测，并且它们的综合的数量或存在的确定确定了对于所述免疫原的抗体的数量或存在。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴维派克，
申请(专利权)人：普拉斯马柯特有限公司，
类型：发明
国别省市：NO[挪威]