利用内胚层干细胞规模化制备功能性胆管细胞的方法及其应用技术

本发明专利技术提供了利用内胚层干细胞规模化制备功能性胆管细胞的方法及其应用，具体地，本发明专利技术提供了一种诱导人类内胚层干细胞分化为胆管细胞和/或胆管细胞群的方法，包括步骤：在培养体系中培养内胚层干细胞，从而获得功能性的胆管细胞和/或胆管细胞群。本发明专利技术的功能性的胆管细胞和/或胆管细胞群具有非常高的分化率和纯度，并且，本发明专利技术的胆管细胞和/或胆管细胞群可作为药物筛选和药物毒性评价的体外模型。

Preparation and application of functional bile duct cells from endodermal stem cells

【技术实现步骤摘要】
利用内胚层干细胞规模化制备功能性胆管细胞的方法及其应用
本专利技术涉及生物技术和细胞治疗领域。具体地，本专利技术涉及利用内胚层干细胞规模化制备功能性胆管细胞的方法及其应用。
技术介绍
肝脏由多种细胞类型组成，包括肝实质细胞、胆管细胞、内皮细胞、间充质细胞、枯丕细胞及循环血液细胞。肝脏实质细胞是肝脏的主要细胞组成，其为上皮样细胞，主要参与解毒、代谢调控及蛋白合成。此外，肝脏的另一类上皮样细胞为胆管细胞，其主要参与肝内胆管及肝外胆管的形成，负责肝细胞所生成的胆汁向小肠内的运输、修饰及分泌。目前，成人与儿童内，胆管疾病均具有较高的致病率与死亡率。该疾病是胆管内上皮样细胞在遗传或环境因素的作用下表现出一系列紊乱行为的疾病，并最终导致终末肝病或恶变的转化。该疾病种类较多，如发育相关的Alagille综合症，遗传相关的多囊纤维化肝脏疾病，自身免疫相关的原发性硬化胆管炎及原发性胆管坏死，不明原因的胆管闭锁。但对于这些疾病并无较为有效的治疗方案，对于较为严重的患者肝脏移植则为相对有效的治疗方法。胆管疾病有效治疗方案的发展往往受限于对发病机理研究的不足，多因原代胆管组织或细胞在体外较难获得及培养，而动物模型则又很难精准的模拟人类疾病。因此，发展较为可靠的，研究人类胆管发育及疾病发生的体外方案，将为胆管疾病的研究提供较为理想的平台。然而目前的制备成熟胆管细胞的方案均高度依赖细胞外基质Matrigel，因此，极大限制成熟胆管细胞的规模化制备。并且，多能干细胞分化存在以下几点问题：1)安全性问题——任何残留在分化体系中的未分化多能干细胞都有可能在体内形成肿瘤(畸胎瘤/Teratoma)；2)分化细胞的功能问题——由多能干细胞直接分化为功能性细胞十分困难，目前由多能干细胞直接分化的终末分化细胞和成体细胞相比，在功能上都有很大的差距；3)分化细胞的纯度问题——多能干细胞的分化多能性决定了：诱导分化成的目标细胞中会参杂相当比例的同一和其他胚层的细胞类群，因而纯化目标细胞十分困难，同时，也使有关胚层之间相互作用的研究难以进行。此外，目前的研究发现，胚胎干细胞或诱导多能干细胞经体外诱导分化虽然可形成具有一定功能的胆管细胞，但其分化效率低，不能规模化制备，同时具有成瘤的危险。因此，本领域迫切需要开发一种能够规模化制备可用于疾病模型及细胞移植的功能性胆管细胞或胆管细胞群的方法。
技术实现思路
本专利技术公开了一种能够规模化制备可用于疾病模型及细胞移植的功能性胆管细胞或胆管细胞群的方法。在本专利技术第一方面，提供了一种诱导人类内胚层干细胞分化为胆管细胞和/或胆管细胞群的方法，包括步骤：(a)在第一培养条件下，在培养体系中培养内胚层干细胞，从而获得经肝脏特化的肝向内胚层(HepaticEndoderm)细胞团；其中，所述培养体系包括bFGF、VEGF、EGF、和BMP4因子；(b)在适合培养的条件下，在培养体系中培养步骤(a)获得的肝向内胚层(HepaticEndoderm)细胞团，从而获得肝母细胞；(c)在适合培养的条件下，在培养体系中培养步骤(b)获得的肝母细胞，从而获得胆管前体细胞；和(d)在第二培养条件下，在培养体系中培养步骤(c)获得的胆管前体细胞，从而获得胆管细胞和/或胆管细胞群；其中，所述培养体系包括HGF、EGF、TGFβ、Dex、和TPPB因子。在另一优选例中，所述第一培养条件含有第一培养基。在另一优选例中，所述第一培养基选自下组：SFD、DMEM、DMEM/F12、或其组合。在另一优选例中，在步骤(b)中，所述培养体系为含有第二培养基和添加物的培养液，所述添加物包括bFGF、VEGF、EGF、HGF、OSM、和Dex因子；在另一优选例中，在步骤(c)中，所述培养体系为含有第三培养基和添加物的培养液，所述添加物包括FGF10、Activin-A、和RetinoicAcid。在另一优选例中，所述的内胚层干细胞来源于人胚胎干细胞或人诱导多能干细胞。在另一优选例中，所述多能干细胞选自下组：人胚胎干细胞系(如H9、Hes2)、人诱导多能干细胞系(如WT-B5-G7)、或其组合。在另一优选例中，所述的内胚层干细胞选自下组：H9、Hes2、WT-B5-G7、或其组合。在另一优选例中，所述第二培养基选自下组：SFD、DMEM、DMEM/F12、或其组合。在另一优选例中，所述第三培养基选自下组：SFD、DMEM、DMEM/F12、或其组合。在另一优选例中，所述第二培养条件含有第四培养基。在另一优选例中，所述第四培养基中选自下组：BDM、SFD、DMEM、或其组合。在另一优选例中，在步骤(a)中，将内胚层干细胞在第一培养条件下培养2-15天，较佳地，3-10天，更佳地，6-7天。在另一优选例中，在步骤(b)中，将肝向内胚层(HepaticEndoderm)细胞团培养2-15天，较佳地，3-10天，更佳地，6-7天。在另一优选例中，在步骤(c)中，将肝母细胞培养2-15天，较佳地，3-10天，更佳地，4-5天。在另一优选例中，在步骤(d)中，将胆管前体细胞在第二培养条件下，培养2-15天，较佳地，3-10天，更佳地，6-7天。在另一优选例中，所述方法具有选自下组的一个或多个特征：(i)高胆管细胞和/或胆管细胞群分化率，所述分化率为80-98.5％，较佳地，90-95％；(ii)在培养过程中，每1ml的培养液中接种1×106个内胚层干细胞，可产生3×106个胆管细胞和/或胆管细胞群；(iii)胆管细胞和/或胆管细胞群为封闭的具有中空结构的单层细胞球囊，球囊直径大小200－400μm，球囊表面胆管细胞大小30-80μm，细胞层厚度5－10μm。在另一优选例中，在步骤(a)－(d)中，所述培养体系中还含有促进分化的其他物质，选自下组：基质胶(Matrigel)、层粘连蛋白(Laminin)、基底膜提取物(BasementMembraneExtracts)、或其组合。在另一优选例中，所述方法包括治疗性和非治疗性的。在另一优选例中，所述的培养体系中，内胚层干细胞的密度为0.5-2x106细胞/ml，较佳地，0.8-1.5x106细胞/ml。在另一优选例中，所述的培养体系为体积50-125ml，较佳地80-125ml，最佳地为80-100ml。在另一优选例中，所述的获得的胆管细胞和/或胆管细胞群的数量M2与所述内胚层干细胞的数量M1之比M2/M1为1－3，较佳地1－2，更佳地1－1.5。在另一优选例中，所述胆管细胞和/或胆管细胞群为功能性胆管细胞和/或胆管细胞群。本专利技术第二方面提供了一种诱导人类内胚层干细胞分化为肝向内胚层细胞团的方法，包括步骤：在第一培养条件下，在培养体系中培养内胚层干细胞，从而获得经肝脏特化的肝向内胚层(HepaticEndoderm)细胞团；其中，所述培养体系包括bFGF、VEGF、EG本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种诱导人类内胚层干细胞分化为胆管细胞和/或胆管细胞群的方法，其特征在于，包括步骤：/n(a)在第一培养条件下，在培养体系中培养内胚层干细胞，从而获得经肝脏特化的肝向内胚层(Hepatic Endoderm)细胞团；其中，所述培养体系包括bFGF、VEGF、EGF、和BMP4因子；/n(b)在适合培养的条件下，在培养体系中培养步骤(a)获得的肝向内胚层(HepaticEndoderm)细胞团，从而获得肝母细胞；/n(c)在适合培养的条件下，在培养体系中培养步骤(b)获得的肝母细胞，从而获得胆管前体细胞；和/n(d)在第二培养条件下，在培养体系中培养步骤(c)获得的胆管前体细胞，从而获得胆管细胞和/或胆管细胞群；其中，所述培养体系包括HGF、EGF、TGFβ、Dex、和TPPB因子。/n

【技术特征摘要】
1.一种诱导人类内胚层干细胞分化为胆管细胞和/或胆管细胞群的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)在第一培养条件下，在培养体系中培养内胚层干细胞，从而获得经肝脏特化的肝向内胚层(HepaticEndoderm)细胞团；其中，所述培养体系包括bFGF、VEGF、EGF、和BMP4因子；
(b)在适合培养的条件下，在培养体系中培养步骤(a)获得的肝向内胚层(HepaticEndoderm)细胞团，从而获得肝母细胞；
(c)在适合培养的条件下，在培养体系中培养步骤(b)获得的肝母细胞，从而获得胆管前体细胞；和
(d)在第二培养条件下，在培养体系中培养步骤(c)获得的胆管前体细胞，从而获得胆管细胞和/或胆管细胞群；其中，所述培养体系包括HGF、EGF、TGFβ、Dex、和TPPB因子。


2.一种诱导人类内胚层干细胞分化为肝向内胚层细胞团的方法，其特征在于，包括步骤：
在第一培养条件下，在培养体系中培养内胚层干细胞，从而获得经肝脏特化的肝向内胚层(HepaticEndoderm)细胞团；其中，所述培养体系包括bFGF、VEGF、EGF、和BMP4因子。


3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第一培养条件含有第一培养基。


4.一种胆管细胞和/或胆管细胞群，其特征在于，所述胆管细胞和/或胆管细胞群为封闭的具有中空结构的单层细胞球囊，其中，所述胆管细胞和/或胆管细胞群的球囊直径大小200－400μm，球囊表面胆管细胞大小50-80μm，细胞层厚度5－10μm。


5.一种权利要求4所述胆管细胞和/或胆管细胞群的用途，其特征在于，用于(a)筛选促进胆管细胞和/或胆管细胞群分化的药物；和/或(ii)评估药物对胆管细胞和/或胆管细胞群毒性。


6.一种诱导培养基，其特征在于，所述诱导培养基含有基础培养基和添加物；其中所述基础培养基选自下组：SFD、DMEM、DMEM/F12、BDM、或其组合；并且，所述添加物包括bFGF、VEGF、EGF、和BMP4因子。


7.一种诱导组合物，其特征在于，包括：
(a)第一诱导因子，所述第一诱导因子包括bFGF、VEGF、EGF、和BMP4因子；
(b)第二诱导因子，所述第二诱导因子包括bFGF、VEGF、EGF、HGF、O...

【专利技术属性】
技术研发人员：程新，冯思思，吴佳颖，周莹，
申请(专利权)人：中国科学院分子细胞科学卓越创新中心，
类型：发明
国别省市：上海;31