一种基于微坑芯片的3D胰岛细胞血管化微球构建方法技术

本发明专利技术提供了一种基于微坑芯片的3D胰岛细胞血管化微球构建方法，该发明专利技术利用软光刻的方法制备具有“金字塔”样的微坑阵列模板，再用聚二甲基硅氧烷（PDMS）制备成具有反金字塔结构的微坑阵列芯片。胰岛细胞(β‑TC6）及胰岛内皮细胞(MS‑1)接种于微坑芯片后，微坑自带倾斜的侧壁，迫使细胞聚集在其底部，进而聚集成三维胰岛细胞团。本发明专利技术所述芯片包含50‑400个凹陷微坑，细胞微球生成灵活可控，通量高，单独细胞微球分离效率高，细胞和试剂用量少；同时，该方法减少了细胞微球与底部的接触面积，更有利于营养物质的充分交换，维持细胞微球的活性和功能。

A construction method of 3D islet cell vascularized microspheres based on microchip

【技术实现步骤摘要】
一种基于微坑芯片的3D胰岛细胞血管化微球构建方法
本专利技术属于微流控技术和细胞生物学领域，具体涉及一种基于微坑芯片的3D胰岛细胞血管化微球构建方法。
技术介绍
微流控芯片实验室是把化学和生物等领域中所涉及的样品制备、反应、分离、检测及细胞培养、分离、分裂等基本操作单元集成到一块几平方厘米(甚至更小)的芯片上，由微通道形成网络，以可控流体贯穿整个系统，用以取代常规化学和生物实验室的各种功能的一种技术平台。微流控芯片的基本特征和最大优势是多种单元技术在整体可控的微小平台上灵活组合、规模集成。高通量是规模集成的一种形式，只是被集成的操作单元或单元群是相同的。随着细胞生物学与组织工程学的发展，细胞三维培养技术正逐渐取代传统二维细胞培养技术。目前，多种类型的细胞都有较强的自组装能力，比如多潜能干细胞、肿瘤细胞、组织细胞等。三维细胞球是由多种细胞自组装形成的三维聚集体，更接近体内组织细胞的结构形态并且更有利于其功能机制的研究。因此，三维细胞球可以被用于众多生物学以及生物医学领域的研究中，例如：发育学、病理学、药理学、癌症治疗等。现有三维细胞聚集培养方法主要有悬滴法、悬浮培养、液滴法等，通过这些方法制备的细胞球的可控性与重复性较差。相比之下，通过具有凹陷结构的芯片进行细胞聚集培养可以实现高通量以及较高的可控性与重复性。目前，大部分的具有凹陷结构的芯片具有垂直的侧壁，在重力作用下细胞沉降在凹陷结构底部进行聚集。然而这种凹陷结构在一定程度上不利于促进细胞聚集成团。由于细胞团直接接触凹陷结构底部导致细胞团不能充分接触营养物质和氧气，大部分死细胞会聚集在侧壁及底部，进一步影响细胞球的活性和功能。本专利技术利用了一种带有倾斜侧壁的微坑芯片进行胰岛细胞聚集培养。倾斜侧壁对细胞产生一定的物理机械力，在与重力的共同作用下有助于促进细胞球的形成。同时，这种三维结构减少了细胞球与底部接触面积，维持了细胞球较好的活性和功能。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于微坑芯片的3D胰岛细胞血管化微球构建方法，以解决以往2D细胞培养存在的不能模拟体内细胞生理环境等局限，本专利技术制备过程稳定，操作简单，集成度高。为解决上述问题，本专利技术提供了一种基于微坑芯片的3D胰岛细胞血管化微球构建方法，该方法的主要步骤包括微坑芯片的制备和三维胰岛细胞血管化微球的制备。微坑芯片的制备具体步骤如下：(1)在硅片表面旋涂300～900微米厚的SU-83035光刻胶，95℃前烘3～6小时；(2)将边长为200～400微米的正方形的阵列掩膜固定于含有光刻胶的基底表面，并置于可以调节倾斜角度以及自由旋转的平台上；(3)紫外曝光时，可以调节平台的倾斜角度(10～80度)，同时每次曝光后平台可以以45度或90度的转角旋转后进行下一次曝光；(4)95℃后烘10～30分钟，自然冷却后用乳酸乙酯溶掉未曝光的SU-8光刻胶，形成具有“金字塔”样的凸起阵列模板；(5)180℃坚膜2小时，最后PDMS反模制备成微坑芯片。三维胰岛细胞血管化微球的制备具体步骤为：将β-TC6胰岛细胞和MS-1胰岛内皮细胞按体积比0.1～5:1接种于具有倾斜侧壁的微坑结构的PDMS芯片内，在倾斜侧壁产生的机械力和重力的共同作用下，细胞聚集在凹陷结构的底部，自组装形成三维胰岛细胞血管化微球。细胞接种密度为105～106个/mL，在微坑芯片加入培养基培养时间为12～24小时。所用培养基为DMEM高糖培养基，其中按质量百分比，含有15％胎牛血清，1％谷氨酰胺和1％双抗。微坑芯片由单层敞口的PDMS芯片组成，所述微坑芯片上设有凹陷微坑，微坑个数为50～300个，PDMS芯片尺寸为长1～3cm、宽1～3cm、高1～2mm。所述微坑芯片的微坑通过调节曝光平台倾斜角度，形成可自由旋转的平台，利用软光刻进行紫外曝光获得。所述微坑芯片的微坑底面为正方形，边长为100～300μm，微坑顶部为正方形敞口，边长为300～900μm，微坑高度为300～900μm，每个微坑单元间距为50～200μm。所述微坑芯片形成的三维胰岛细胞血管化微球尺寸为100～600μm。一种基于微坑芯片的3D胰岛细胞血管化微球构建方法在下列任一项中的应用：1)干细胞诱导分化；2)药物筛选；3)生理以及病理模型的建立；4)肿瘤细胞培养；5)组织细胞培养；6)高通量细胞微球；7)细胞原位培养、给药、增殖、诱导分化以及功能表达。所述微坑芯片利用软光刻进行紫外曝光时，曝光平台可以调节倾斜角度，形成可自由旋转的平台，曝光后形成具有倾斜侧壁的凹陷微坑。该方法可用于单一或多种细胞，例如：干细胞、肿瘤细胞、组织细胞等。通过该方法形成的三维细胞微球具有较好的均一性以及高通量，在三维细胞微球形成之后可应用于各种生物学领域研究，例如：干细胞诱导分化、药物筛选、生理以及病理模型的建立等。所述微坑芯片可接种不同种类的细胞，细胞接种密度为105～106个/mL，在微坑芯片加入培养基培养12～24小时后，细胞会聚集在微坑底部形成细胞微球。通过芯片形成的细胞微球可以继续在芯片上培养，或取出后再另行培养。所述微坑芯片的每个微坑只能形成一个细胞微球，微坑尺寸可满足细胞长期生长、增殖。本专利技术的优点在于：1、操作简便、快捷；2、细胞与试剂用量少，实验成本低廉；3、高度集成化；4、应用范围广泛；附图说明为了更清楚的说明本专利技术的技术方案，将技术方案描述中所需使用的附图作简单的介绍。图1为微坑芯片结构示意图。图2为三维细胞聚集培养示意图。图3微坑芯片中形成的胰岛细胞血管化微球(7天)。图4微坑芯片中胰岛细胞血管化微球的增殖情况(7天)。图5微坑芯片中胰岛细胞血管化微球的分泌胰岛素的定量检测(1、4、7天)。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围不受实施例的限制，如果该领域的技术熟练人员根据上述
技术实现思路
对本专利技术作出一些非本质的改进和调整，仍属于本专利技术的保护范围。一种基于微坑芯片的3D胰岛细胞血管化微球构建方法，利用软光刻的方法制备如图1所示具有“金字塔”样的微坑阵列模板，再用PDMS制备成具有反金字塔结构的微坑阵列芯片。胰岛细胞(β-TC6)及胰岛内皮细胞(MS-1)细胞接种于微坑芯片后，微坑自带倾斜的侧壁，迫使细胞聚集在其底部，进而聚集成三维胰岛细胞团。该芯片的特点在于每个微坑形成一个3D胰岛血管化微球，微球生成灵活可控，通量高，单独细胞微球分离效率高，微坑结构更有利于营养物质的充分交换，维持胰岛血管化微球的活性和功能。实施例1一种用于3D胰岛细胞血管化微球形成的微坑芯片的制备在50mm直径的圆形抛光硅片表面旋涂500μm厚的SU-83035光刻胶，95℃前烘3小时；将边长为300微米的正方形的阵列掩膜固定于含有光刻本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于微坑芯片的3D胰岛细胞血管化微球构建方法，其特征在于：该方法的主要步骤为：/n(1)微坑芯片的制备；/n(2)三维胰岛细胞血管化微球的制备。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于微坑芯片的3D胰岛细胞血管化微球构建方法，其特征在于：该方法的主要步骤为：
(1)微坑芯片的制备；
(2)三维胰岛细胞血管化微球的制备。


2.根据权利要求1所述基于微坑芯片的3D胰岛细胞血管化微球构建方法，其特征在于：所述微坑芯片由单层敞口的PDMS芯片组成，所述微坑芯片上设有凹陷微坑，微坑个数为50～300个；
所述PDMS芯片尺寸为长1～3cm、宽1～3cm、高1～2mm。


3.根据权利要求2所述基于微坑芯片的3D胰岛细胞血管化微球构建方法，其特征在于：所述微坑芯片的微坑通过调节曝光平台倾斜角度，形成可自由旋转的平台，利用软光刻进行紫外曝光获得。


4.根据权利要求2所述基于微坑芯片的3D胰岛细胞血管化微球构建方法，其特征在于：所述微坑芯片的微坑底面为正方形，边长为100～300μm，微坑顶部为正方形敞口，边长为300～900μm，微坑高度为300～900μm，每个微坑单元间距为50～200μm。


5.根据权利要求1所述基于微坑芯片的3D胰岛细胞血管化微球构建方法，其特征在于：所述步骤(1)微坑芯片的制备制备方法包括以下步骤：
(1)在硅片表面旋涂300～900微米厚的SU-83035光刻胶，95℃前烘3-6小时；
(2)将边长为200～400微米的正方形的阵列掩膜固定于含有光刻胶的基底表面，并置于可以调节倾斜角度以及自由旋转的平台上；
(3)紫外曝光时，可以调节平台的倾斜角度为10～80度，同时每次曝光后平台可以以45度或90度的转角旋转后进行下一次曝光；
(4)95℃后烘10～30分钟，自然冷却后用...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦建华，张晓庆，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21