一种人自体脂肪血管基质成分SVF的提取试剂及提取方法技术

本发明专利技术提供一种人自体脂肪血管基质成分SVF的提取试剂及提取方法，所述提取方法为采集脂肪组织，清洗离心后加入等体积的SVF提取试剂振荡消化，离心获得沉淀物，沉淀物清洗离心过滤获得SVF细胞；本发明专利技术的海藻糖溶液对细胞膜蛋白有保护作用，胶原酶溶液和明胶溶液可促进细胞增殖迁移，可提高溶液粘稠度，降低溶液剪切力；达到保护细胞，提高脂肪组织中细胞存活率的目的。

An extraction reagent and method of SVF from human autogenous fatty vascular matrix

【技术实现步骤摘要】
一种人自体脂肪血管基质成分SVF的提取试剂及提取方法
本专利技术涉及生物
，特别涉及一种人自体脂肪血管基质成分SVF的提取试剂及提取方法。
技术介绍
脂肪血管基质组分(stromalvascularfraction，SVF)是脂肪组织经消化、离心去除成熟的脂肪组织、结缔组织，得到一种含间充质干细胞(6.7％)、内皮前体细胞(2％)和单核细胞/巨噬细胞(10％)等多种细胞的混合物。脂肪组织及骨髓中均可提取出SVF细胞，但在脂肪组织中，1％～10％的有核细胞被认为是干细胞，而骨髓中只有0.0001～0.01％的有核细胞是干细胞。可以从一克脂肪组织中获得的干细胞数量约为5000-200000个细胞。SVF细胞中的干细胞可分泌多种细胞因子、趋化因子、生长因子和外泌体。这些物质对周围组织器官有积极的影响，如缓解炎症、改善微循环等。植入组织内的干细胞，也可分化成组织特异性细胞。如SVF在关节炎治疗方面有较好的治疗效果。2011，PAK采用自体SVF和富血小板血浆和透明质酸成功地治疗了2例人类膝关节骨关节炎患者。此后临床治疗关节炎越来越广泛，据临床研究资料显示，已有研究人员对1114例关节炎患者予以临床治疗。2013年，Pak等人治疗了91位患者，其中65％的人群表述治疗3个月后有效果；Bui等人对2级和3级21位关节炎患者予以SVF治疗，VAS评价及Lysholm评价均显示患者在8.5个月关节功能得到改善。目前关节炎治疗主要有药物治疗如非甾体类抗炎药(NSAIDs)、类固醇和透明质酸(RAS)；物理疗法如针灸、职业训练等；手术治疗如关节腔穿刺、关节置换、关节矫形等；免疫及生物治疗如干细胞移植、血浆置换等。药物治疗、物理疗法，都旨在纠正症状，而不是治疗潜在的原因。当药物治疗和物理疗法治疗失败时，患者通常进行全膝关节置换(TKR)或全髋关节置换术(THR)手术。TKR和THR手术均具有较高的发病率和死亡率。全膝关节置换术后的第30天死亡率为0.18％，5.6％的患者出现并发症。全髋关节置换术后30天和90天的死亡率分别为0.24％和0.55％。：SVF采用患者自身脂肪组织，回输到体内不会出现任何副作用，且细胞治疗不需对关节进行破坏性处理，通过SVF自发迁移至受损部位而生成软骨组织。细胞回输后仅需静养几天即可进行正常的生活、工作。SVF还可对关节炎症、肌腱缺失、髌骨软骨软化、半月板缺失等关节部位均有一定的治疗效果。目前SVF细胞提取一般将脂肪组织清洗离心后加入等体积的胶原酶以150-280rpm，37℃振荡消化30-60min，离心获得沉淀物，沉淀物清洗离心过滤获得SVF细胞。但这种组织消化方式中的酶消化作用过长及振荡产生的剪切力均对细胞活率有较大影响。
技术实现思路
鉴以此，本专利技术提出一种人自体脂肪血管基质成分SVF的提取试剂及提取方法。本专利技术的技术方案是这样实现的：一种人自体脂肪血管基质成分SVF的提取试剂，所述提取试剂包括以下原料：胶原酶、海藻糖及明胶。进一步的，所述提取试剂包括以下原料：0.1-1w/w％胶原酶溶液、2-10w/w％的海藻糖溶液及0.05-0.15w/w％的明胶溶液。进一步的，所述胶原酶溶液、海藻糖溶液、明胶溶液的体积比为0.8-1.2：0.8-1.2：0.8-1.2。进一步的，所述胶原酶溶液、海藻糖溶液、明胶溶液为DMEM培养基。进一步的，人自体脂肪血管基质成分的提取方法，包括以下步骤：S1、采集脂肪组织，用pH值为7.2-7.4的PBS清洗2-4遍；S2、清洗后的脂肪组织去除洗涤液，加入提取试剂，在30～40℃振荡消化30-60min，离心后弃除上层消化液、油脂及红细胞；S3、加入生理盐水洗涤沉淀细胞，900～1400rpm离心2～8min去除上清，沉淀加入8～12倍体积量的生理盐水重悬细胞，80～120μm过滤SVF细胞；S4、SVF再次离心，8～12倍体积量生理盐水重悬细胞，用20～60μm滤器过滤细胞，得到SVF细胞。进一步的，所述S2步骤的振荡频率为150-280rpm。进一步的，所述S3步骤加入5～10倍体积的生理盐水洗涤沉淀细胞。进一步的，人自体脂肪血管基质成分应用于现有临床治疗技术对骨关节炎、关节软骨缺损、软骨损伤与退变等疾病治疗。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术提供一种脂肪血管基质组分的提取试剂，由DMEM配制的胶原酶，海藻糖及明胶组成的混合溶液，本专利技术的海藻糖溶液对细胞膜蛋白有保护作用，胶原酶溶液和明胶溶液可促进细胞增殖迁移，可提高溶液粘稠度，降低剪切力对细胞的破坏。其中的SVF用生理盐水洗涤，并用滤网去除细胞液中的块状物质；本专利技术能够减少组织或细胞离心，降低离心转速及离心时间，减少剪切力对细胞的破坏，达到保护细胞，提高脂肪组织中细胞存活率的目的；可提供一种临床级脂肪SVF制备方法，应用于现有临床治疗技术对骨关节炎、关节软骨缺损、软骨损伤与退变等疾病治疗。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的优选实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为实施例3细胞图；图2为对比例1细胞图。具体实施方式为了更好理解本专利技术
技术实现思路
，下面提供具体实施例，对本专利技术做进一步的说明。本专利技术实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。本专利技术实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1一种人自体脂肪血管基质成分SVF的提取试剂，所述提取试剂包括以下原料：0.1w/w％胶原酶溶液、2w/w％的海藻糖溶液及0.05w/w％的明胶溶液，将体积比为0.8：0.8：1.2的胶原酶溶液、海藻糖溶液、明胶溶液混合配制成低糖型DMEM的SVF提取试剂。实施例2一种人自体脂肪血管基质成分SVF的提取试剂，所述提取试剂包括以下原料：1w/w％胶原酶溶液、10w/w％的海藻糖溶液及0.15w/w％的明胶溶液，将体积比为1.2：1.2：0.8的胶原酶溶液、海藻糖溶液、明胶溶液混合配制成低糖型DMEM的SVF提取试剂。实施例3一种人自体脂肪血管基质成分SVF的提取试剂，所述提取试剂包括以下原料：0.5w/w％胶原酶溶液、4w/w％的海藻糖溶液及0.15w/w％的明胶溶液，将体积比为1:1:1的胶原酶溶液、海藻糖溶液、明胶溶液混合配制成低糖型DMEM的SVF提取试剂。上述实施例1～3还提供人自体脂肪血管基质成分的提取方法，包括以下步骤：S1、取50ml脂肪组织，加入pH值为7.2的PBS反复振荡洗涤，待静置分层后，吸弃下层洗涤液，反复2次至洗涤液无色。S2、将脂肪组织分装到2支50ml离心管中，加入等体积的SVF提取试剂，置于30℃振荡培养本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人自体脂肪血管基质成分SVF的提取试剂，其特征在于：所述提取试剂包括以下原料：胶原酶、海藻糖及明胶。/n

【技术特征摘要】
1.一种人自体脂肪血管基质成分SVF的提取试剂，其特征在于：所述提取试剂包括以下原料：胶原酶、海藻糖及明胶。


2.如权利要求1所述的一种人自体脂肪血管基质成分SVF的提取试剂，其特征在于：所述提取试剂包括以下原料：0.1-1w/w％胶原酶溶液、2-10w/w％的海藻糖溶液及0.05-0.15w/w％的明胶溶液。


3.如权利要求2所述的一种人自体脂肪血管基质成分SVF的提取试剂，其特征在于：所述提取试剂由胶原酶溶液、海藻糖溶液、明胶溶液体积比为0.8-1.2：0.8-1.2：0.8-1.2。


4.如权利要求1所述的一种人自体脂肪血管基质成分SVF的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、采集脂肪组织，用pH值为7.2-7.4的PBS清洗2-4遍；
S2、清洗后的脂肪组织去除洗涤液，加入权利要求书1～3任一项所述的提取试剂，在30...

【专利技术属性】
技术研发人员：湛振键，邱伟勤，齐国光，
申请(专利权)人：海口健康岛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：海南;46