一种特异性纳米抗体Nb2F7及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种特异性纳米抗体Nb2F7及其应用。本发明专利技术提供了一种特异性纳米抗体Nb2F7，所述纳米抗体Nb2F7的VHH的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。该纳米抗体Nb2F7能够特异性识别19‑NT，且具有优异的有机溶剂耐受性，不会受到在实际样品检测前处理过程中加入的有机溶剂的影响，检测结果准确度高，对19‑NT的检测范围为0.34ng/mL～8.32ng/mL，IC50为1.14ng/mL，最低检测限为0.16ng/mL，检测灵敏度高，且操作简单、所耗时间较短；另外，该纳米抗体Nb2F7的制备方法简单，具有普遍适用性；因此，该纳米抗体Nb2F7在检测19‑去甲睾酮、制备19‑去甲睾酮检测试剂/试剂盒中具有广泛的应用前景。

A specific nano antibody nb2f7 and its application

【技术实现步骤摘要】
一种特异性纳米抗体Nb2F7及其应用
本专利技术属于生物
更具体地，涉及一种特异性纳米抗体Nb2F7及其应用。
技术介绍
19-去甲睾酮(19-nortestosterone，19-NT)简称诺龙，是睾酮甾环结构上脱去第19位碳原子而形成的内源性和外源性蛋白同化激素，其具有很强的促蛋白质合成能力，能参与生长发育的生理调节，促进骨骼和肌肉的生长，减少脂肪贮积。因此，许多国家和地区将19-NT用作畜禽生长促进剂，以改善生产性能，提高饲料报酬。临床主要用于治疗贫血老年性骨质疏松，还能促进人体肌肉的生长发育，增加训练耐力和训练负荷，运动员服用19-NT后，能增强肌肉力量，结合适度的锻炼和饮食，可提高比赛成绩。但研究表明，19-NT及其代谢物残留可影响人的肝脏功能，损害心血管系统，还可造成生殖器官受损、肾上腺萎缩、情绪失控及内分泌失调等毒副作用。这就要求对食源性动物生产进行严格的激素滥用监测，以保护消费者的身心健康。因此，亟需一种快速、灵敏、高效的检测方法来实现对19-NT的快速检测。现有常见的检测19-NT的方法有：薄层色谱法、气相色谱法(简称GC)、高效液相色谱法(简称HPLC)、气相色谱-质谱法、液相色谱质谱联用法以及其他定量检测方法。但这些方法需要专业的技术人员、繁琐的样品前处理过程和昂贵的仪器设备，不适合大批量市场检测和现场监控。而免疫学检测技术灵敏度高、特异性强、操作简单、价格低廉，能够实现对生物液体的小体积、大通量检测，逐渐成为有毒有害残留物检测的替代方法。目前，19-NT残留分析一般使用气相色谱法、高效液相色谱法及色谱质谱联用技术，这些方法灵敏、准确，但样品前处理复杂、繁琐费时，且需要昂贵的仪器设备和专业的操作人员，检测成本高，难以满足样品现场、批量、快速检测的需要。因此，开发一种简单快速、适用于兽药残留现场监控的分析方法具有重要意义。而基于抗体(单克隆抗体和多克隆抗体)建立的免疫分析方法，虽然具有快速、灵敏、高通量的优势，但是在极端条件下抗体往往稳定性差，容易失活，且在实际样品检测前，对样品的前处理过程需要用到有机溶剂，而有机溶剂的残留使得以单克隆抗体和多克隆抗体为主的免疫学检测的灵敏度、准确度大大降低。因此，研发一种稳定性好、准确度高、灵敏度强的快速检测19-NT的方法，具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是为了克服上述现有技术的不足，提供一种19-NT特异性纳米抗体Nb2F7及其应用。本专利技术的目的是提供一种特异性纳米抗体Nb2F7。本专利技术另一目的是提供一种编码所述纳米抗体Nb2F7的基因。本专利技术又一目的是提供一种特异性纳米抗体Nb2F7表达载体。本专利技术又一目的是提供一种重组细胞。本专利技术又一目的是提供所述纳米抗体Nb2F7、所述基因、所述表达载体或所述重组细胞在检测19-去甲睾酮中的应用。本专利技术又一目的是提供所述纳米抗体Nb2F7、所述基因、所述表达载体或所述重组细胞在制备19-去甲睾酮检测试剂/试剂盒中的应用。本专利技术再一目的是提供一种检测19-去甲睾酮的方法。本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：本专利技术首先提供了一种特异性纳米抗体Nb2F7，所述纳米抗体Nb2F7的VHH的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。所述纳米抗体Nb2F7包括4个框架区FR1、FR2、FR3、FR4和3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，所述4个框架区和3个互补决定区的排列顺序为FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4；其中，所述FR1的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，所述FR2的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，所述FR3的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示，所述FR4的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示，所述CDR1的氨基酸序列如SEQIDNO.6所示，所述CDR2的氨基酸序列如SEQIDNO.7所示，所述CDR3的氨基酸序列如SEQIDNO.8所示。本专利技术还提供了一种编码所述纳米抗体Nb2F7的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO.9所示。本专利技术还提供了一种特异性纳米抗体Nb2F7表达载体，所述表达载体包括所述基因的核苷酸序列。本专利技术还提供了一种重组细胞，所述重组细胞转染有所述表达载体。本专利技术经过创造性的探索研究，通过用噬菌体展示技术，从骆驼免疫抗体文库中筛选得到了能与19-NT特异性结合的纳米抗体Nb2F7，该纳米抗体Nb2F7能够特异性识别19-NT，且具有优异的有机溶剂(甲醇、乙腈)耐受性，不会受到在实际样品检测前处理过程中加入的有机溶剂的影响，检测结果准确度高。因此，所述纳米抗体Nb2F7、所述基因、所述表达载体或所述重组细胞在检测19-去甲睾酮、制备19-去甲睾酮检测试剂/试剂盒中的应用，均应在本专利技术的保护范围之内。另外，本专利技术还提供了一种检测19-去甲睾酮的方法，用含有式(I)所述19-去甲睾酮半抗原与载体蛋白偶联得到的19-去甲睾酮完全抗原作为包被原，用权利要求1所述的纳米抗体Nb2F7作为检测抗体进行检测。优选地，所述19-去甲睾酮半抗原的结构式如式(I)所示：优选地，所述载体蛋白为卵清白蛋白。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术提供了一种特异性纳米抗体Nb2F7及其应用。本专利技术从骆驼免疫抗体文库中筛选得到了一种特异性纳米抗体Nb2F7，该纳米抗体Nb2F7能够特异性识别19-NT，且具有优异的有机溶剂(甲醇、乙腈)耐受性，不会受到在实际样品检测前处理过程中加入的有机溶剂的影响，检测结果准确度高，对19-NT的检测范围为0.34ng/mL～8.32ng/mL，IC50为1.14ng/mL，最低检测限为0.16ng/mL，检测灵敏度高，且操作简单、所耗时间较短；另外，通过基因工程重组表达的方式即可大量制备该纳米抗体Nb2F7，制备方法简单，具有普遍适用性；因此，该纳米抗体Nb2F7在检测19-去甲睾酮、制备19-去甲睾酮检测试剂/试剂盒中具有广泛的应用前景。附图说明图1是特异性纳米抗体Nb2F7的氨基酸编号及结构域示意图。图2是基于特异性纳米抗体Nb2F7建立的间接竞争ELISA标准曲线图。图3是不同比例甲醇/PBS作为稀释液时特异性纳米抗体Nb2F7的活性曲线图。图4是不同比例乙腈/PBS作为稀释液时特异性纳米抗体Nb2F7的活性曲线图。具体实施方式以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本专利技术，但实施例并不对本专利技术做任何形式的限定。除非特别说明，本专利技术采用的试剂、方法和设备为本
常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。实施例1骆驼免疫抗体文库的构建(1)完全抗原19-NT-KLH和19-NT-OVA的制备把结构式如式(I)所示的19-去甲睾酮半抗原与卵清白蛋白(OVA)和匙孔血蓝蛋白(KLH)通过活泼酯方法偶联，制备获得完全抗原19-NT-K本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种特异性纳米抗体Nb2F7，其特征在于，所述纳米抗体Nb2F7的VHH的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种特异性纳米抗体Nb2F7，其特征在于，所述纳米抗体Nb2F7的VHH的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。


2.根据权利要求1所述的纳米抗体Nb2F7，其特征在于，所述纳米抗体Nb2F7包括4个框架区FR1、FR2、FR3、FR4和3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，所述4个框架区和3个互补决定区的排列顺序为FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4；其中，所述FR1的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，所述FR2的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，所述FR3的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示，所述FR4的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示，所述CDR1的氨基酸序列如SEQIDNO.6所示，所述CDR2的氨基酸序列如SEQIDNO.7所示，所述CDR3的氨基酸序列如SEQIDNO.8所示。


3.一种编码权利要求1所述纳米抗体Nb2F7的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO.9所示...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈玉栋，王弘，杨媛媛，张咏仪，陈浩宇，徐振林，肖治理，孙远明，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44