本发明专利技术涉及一种可结合CTLA4的多肽，包括3个互补决定区CDR1‑3，CDR1序列为或包括SEQ ID NO:1‑8所示序列之一，CDR2序列为或包括SEQ ID NO:9‑16所示序列之一，CDR3序列为或包括SEQ ID NO:17‑25所示序列之一。本发明专利技术针对肿瘤患者进行纳米抗体药物开发，通过制备CTLA4蛋白、免疫小羊驼、利用噬菌体库展示纳米单抗的平台技术等，筛选到特异性结合CTLA4的纳米抗体VHH，鉴定了其CDR序列。本发明专利技术为肿瘤和传染病患者临床治疗提供潜在的纳米抗体新药。
CTLA4 binding peptides and their applications
【技术实现步骤摘要】
可结合CTLA4的多肽及其应用
本专利技术涉及生物医药领域。更特别地，涉及一种可结合CTLA4的多肽，所述的多肽在制备CTLA4检测剂或肿瘤患者治疗药物中的应用。
技术介绍
肿瘤是指机体局部组织的细胞异常增生而形成的一种新生物，常常表现为局部的肿块。根据肿瘤的性质，一般将其分为良性肿瘤和恶性肿瘤。恶性肿瘤生长较快，易向周围组织扩散，容易发生转移，危及生命。细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(cytotoxicTlymphocyteantigen-4，CTLA-4)是T细胞表面表达的一种共刺激分子，与CD28高度同源，具有共同配体B7-1(CD80)和B7-2(CD86)。少量CTLA-4即可有效与CD28竞争性结合配体，削弱CD28与配体的结构和，，抑制T细胞激活的信号传递。。1993年，一种来源于骆驼科的新型天然抗体被发现。该抗体天然缺失轻链而只由重链组成，其重链包含两个恒定区(CH2和CH3)、一个铰链区和一个重链可变区(Variableheavychaindomain，VHH，即抗原结合位点)，该重链可变区的相对分子质量约为13KDa，仅为常规抗体的1/10，且分子高度和直径均在纳米级别，是目前可获得的最小的功能性抗体片段，因此又被称为纳米单抗(Nanobody，Nb)。因纳米单抗稳定性高(90℃条件下仍不会降解)、亲和力高、与人源抗体同源性超过80％、毒性和免疫原性均较低等特点，最近纳米单抗被广泛用于免疫诊断试剂盒研发、影像学研发以及针对肿瘤、炎症、传染病和神经系统疾病等领域的抗体药物研发。目前已有一些抗CTLA4抗体用于治疗黑色素瘤，但是，往往具有严重的副作用，限制了抗CTLA-4的应用。因此，需要制备新的抗CTLA-4抗体，为研发副作用更小的抗肿瘤和抗传染病的新药做储备。
技术实现思路
本专利技术通过用抗原免疫小羊驼，获取骆驼源纳米单抗及其VHH，用于诊断和治疗高表达CTLA4的病人。基于这些研究，本专利技术提供了一种可结合CTLA4的多肽，包括3个互补决定区CDR1-3，CDR1序列为或包括SEQIDNO:1-8所示序列之一，CDR2序列为或包括SEQIDNO:9-16所示序列之一，CDR3序列为或包括SEQIDNO:17-25所示序列之一。在一个具体实施方案中，所述多肽还包括4个框架区FR1-4，所述FR1-4与所述CDR1-3交错排列。框架区的序列可根据物种来设计。例如，可将FR1-4序列设计为如SEQIDNO:26-29所示，但本专利技术的范围不限于此，也可将框架区FR1-4序列人源化为如SEQIDNO:30-33所示。抗体的特异性识别和结合能力主要由CDR区序列决定，FR序列影响不大，可根据物种来设计，这是本领域公知的。例如，可设计人源、鼠源或羊驼源的FR区序列来连接上述CDR，从而得到一个可结合人PD1的多肽或结构域。在一个优选实施方案中，所述多肽为单克隆抗体。在一个优选实施方案中，所述多肽为VHH。在一个优选实施方案中，所述多肽为骆驼源的VHH或人源化的VHH。在一个具体实施方案中，所述多肽的CDR序列如下：I)CDR2的序列为SEQIDNO：34，其中，第二位的X表示丝氨酸或苏氨酸；并且II)CDR1的序列为SEQIDNO:1或2；并且CDR3的序列选自SEQIDNO:17-19。优选地，CDR1的序列为SEQIDNO:1，CDR2的序列为SEQIDNO:9并且CDR3的序列为SEQIDNO:17；或CDR1的序列为SEQIDNO:1，CDR2的序列为SEQIDNO:9并且CDR3的序列为SEQIDNO:18；或CDR1的序列为SEQIDNO:2，CDR2的序列为SEQIDNO:10并且CDR3的序列为SEQIDNO:19。在一个具体实施方案中，CDR1的序列为SEQIDNO:3，CDR2的序列为SEQIDNO:11并且CDR3的序列为SEQIDNO:20。在一个具体实施方案中，CDR1的序列为SEQIDNO:4，CDR2的序列为SEQIDNO:12并且CDR3的序列为SEQIDNO:21。在一个具体实施方案中，CDR1的序列为SEQIDNO:5，CDR2的序列为SEQIDNO:13并且CDR3的序列为SEQIDNO:22。在一个具体实施方案中，CDR1的序列为SEQIDNO:6，CDR2的序列为SEQIDNO:14并且CDR3的序列为SEQIDNO:23。在一个具体实施方案中，CDR1的序列为SEQIDNO:7，CDR2的序列为SEQIDNO:15并且CDR3的序列为SEQIDNO:24。在一个具体实施方案中，CDR1的序列为SEQIDNO:8，CDR2的序列为SEQIDNO:16并且CDR3的序列为SEQIDNO:25。本专利技术还提供了上述多肽在肿瘤或传染病治疗药物中的应用。本专利技术还提供了上述多肽的核酸编码序列。在一个实施方案中，所述核酸序列为DNA序列或RNA序列。在一个具体实施方案中，所述核酸序列存在于基因表达框中。本专利技术还提供了上述多肽在肿瘤治疗药物中的应用。本专利技术针对通过CTLA-4途径逃避免疫机制的肿瘤和传染病患者进行纳米抗体药物开发，通过制备CTLA-4蛋白、免疫小羊驼、利用噬菌体库展示纳米单抗的平台技术等，筛选到特异性结合CTLA-4蛋白的纳米抗体VHH，鉴定了其CDR序列。本专利技术为通过CTLA-4途径逃避免疫机制的肿瘤和传染病患者临床治疗提供潜在的纳米抗体新药。附图说明图1为sCTLA4第4和5次免疫骆驼一周后的抗血清效价检测曲线；图2为不同稀释度的第5次免疫骆驼一周后的抗血清与细胞表达的CTLA4结合曲线，以免疫前的血清为对照；图3为sCTLA4-VHH噬菌体抗体文库为模板扩增的PCR产物的电泳图；图4为sCTLA4-VHH噬菌体抗体文库的淘选鉴定，其中，A为噬菌体文库针对sCTLA4蛋白淘选后ELISA检测统计图；B为从第二轮(2nd)和第三轮(3rd)淘选后的噬菌体抗体文库分别挑选39和47个克隆进行噬菌体ELISA检测统计图；图5为原核表达的VHH抗体的ELISA检测统计图，每个点代表一个克隆，纵坐标为针对sGN的OD450/空白对照的OD450，比值大于5.0定义为阳性。具体实施方式1.免疫原的制备我们依据NCBI网站上的CTLA4蛋白序列和基因序列信息，分析并设计了可有效诱导小羊驼产生针对CTLA4蛋白的特异性抗体的多肽sCTLA4，在C端连接His-tag(sCTLA4-his)或兔Fc(sCTLA4-rFc)用于后续纯化及检测。2.骆驼免疫与抗血清的获得用250μgsCTLA4-rFc蛋白与250μl弗氏完全佐剂的乳化混合物对小羊驼进行初免，在第14天、28天、42天、56天用sCTLA4-rFc蛋白与250μl弗氏不完全佐剂加强免疫3次，第2次、第3次和第4次免疫1周后，采血检测抗血清滴度；第5本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种可结合CTLA4的多肽，其特征在于，包括3个互补决定区CDR1-3，CDR1序列为或包括SEQ ID NO:1-8所示序列之一，CDR2序列为或包括SEQ ID NO:9-16所示序列之一，CDR3序列为或包括SEQ ID NO:17-25所示序列之一。/n
【技术特征摘要】
1.一种可结合CTLA4的多肽，其特征在于，包括3个互补决定区CDR1-3，CDR1序列为或包括SEQIDNO:1-8所示序列之一，CDR2序列为或包括SEQIDNO:9-16所示序列之一，CDR3序列为或包括SEQIDNO:17-25所示序列之一。
2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽还包括4个框架区FR1-4，所述FR1-4与所述CDR1-3按顺序交错排列。
3.根据权利要求2所述的多肽，其特征在于，所述多肽为单克隆抗体。
4.根据权利要求2所述的多肽，其特征在于，所述多肽为VHH。
【专利技术属性】
技术研发人员：吴稚伟，吴喜林，施海霞，赵振民，
申请(专利权)人：源道隆苏州医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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