可结合HPV18病毒的蛋白质及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种可结合HVP18的蛋白质，包括VH区和VL区，其中，所述VH区包括三个CDR区，序列为SEQ ID NO:5或11、SEQ ID NO:6或12以及SEQ ID NO:7或13；所述VL区包括三个CDR区，序列为SEQ ID NO:8或14、SEQ ID NO:9或15以及SEQ ID NO:10或16。本发明专利技术获得了表达抗HPV18 VLP且可中和HPV18病毒的抗体的杂交瘤细胞株，并克隆了抗HPV18 VLP抗体的可变区核苷酸序列。本发明专利技术的抗HPV18 VLP抗体可与HPV18 VLP颗粒特异性结合，且可中和HPV18假病毒颗粒，因此可以应用于HVP18型感染病人的检测和治疗。

Protein binding to HPV18 and its application

【技术实现步骤摘要】
可结合HPV18病毒的蛋白质及其应用
本专利技术涉及生物医药领域。更特别地，涉及一种可特异性中和HPV18病毒的单克隆抗体及其应用。
技术介绍
人乳头瘤病毒(Humanpapillomavirus，HPV)是世界范围内一组极为常见的病毒。是一种嗜上皮性病毒，在人和动物中分布广泛，有高度的宿主特异性，只有人类会被HPV感染。两种类型的人乳头瘤病毒(16型和18型)引起70％的宫颈癌和宫颈癌前病变。几乎所有宫颈癌病例都是由人乳头瘤病毒感染导致。全球每年宫颈癌的新发病例为52.8万。在中国大陆已上市两种HPV疫苗(二价和四价)，均可用于预防高危型HPV，但目前接种率仍较低，部分个体即使接种疫苗仍无抗病毒抗体产生，且疫苗不能治疗人乳头瘤病毒感染或宫颈癌等与人乳头瘤病毒有关的疾病。目前，临床上尚无直接针对HPV的特异性治疗药物，主要通过物理治疗及干扰素等辅助治疗，难以彻底清除体内病毒，易于复发。因此，需要研发出专门针对HPV病毒的抗体，作为宫颈癌等于HPV有关的疾病的治疗药物。
技术实现思路
本专利技术通过用抗原免疫Balb/c小鼠，获取单克隆抗体，用于治疗HPV18感染。基于这些研究，本专利技术提供了一种可结合HVP18的蛋白质，包括VH区和VL区，其中，所述VH区包括三个CDR区，序列分别为SEQIDNO:5或11、SEQIDNO:6或12以及SEQIDNO:7或13；所述VL区包括三个CDR区，序列分别为SEQIDNO:8或14、SEQIDNO:9或15以及SEQIDNO:10或16。在一个具体实施方案中，所述VH区序列如SEQIDNO:1或3所示，所述VL区序列如SEQIDNO:2或4所示。需要说明的是尽管本专利技术提供了FR序列来与CDR序列连接，获得SEQIDNO:1或3所示的VH序列和SEQIDN0:2和4所示的VL序列，但是，抗体与抗原的结合本质上取决于CDR序列，本领域技术人员在阅读了本专利技术的后可容易地根据上述CDR序列在组装成各种VH和VL，只需要改动FR序列或使用不同来源的FR序列即可，这些改变均为本领域技术人员根据本专利技术的内容在本领域公知技术上做出的改变，应落在本专利技术的保护范围内。在一个具体实施方案中，所述蛋白质为免疫球蛋白。在一个具体实施方案中，所述VH区和VL区分别位于不同多肽链上。在一个具体实施方案中，所述蛋白质为单链抗体，所述VH区和VL区位于同一条多肽链上。本专利技术还提供了上述蛋白质在制备HPV18检测剂中的应用。本专利技术还提供了上述蛋白质在制备HPV18感染治疗药物中的应用。本专利技术还提供了一种核编码上述蛋白质酸。本专利技术还提供了上述核酸在制备基因治疗药物中的应用。例如，可通过将上述核酸序列搭载在AAV系统中，用于基因治疗。本专利技术针对高危病毒HPV18进行中和抗体药物开发，通过制备HPV18VLP、免疫Balb/c小鼠、利用电融合技术平台等，筛选到特异性结合HPV18VLP的单克隆抗体鉴定了其CDR序列。本专利技术为HPV18病毒感染的临床治疗提供潜在的抗体新药。附图说明图1为3免后小鼠抗血清效价检测曲线；图2为融合后杂交瘤克隆上清以HPV18VLP进行ELISA初筛的结果汇总图；图3为单克隆抗体2A12和8H4的分型统计图；图4为单克隆抗体2A12和8H4与9个HPV亚型VLP蛋白ELISA反应性的统计图；图5为单克隆抗体2A12和8H4与9个HPV亚型VLP颗粒结合的荧光显微照片；图6为单克隆抗体2A12和8H4与9个HPV亚型VLP颗粒结合的流式分析统计图；图7为不同浓度的单克隆抗体2A12和8H4对HPV18假病毒中和活性的统计图；图8为单克隆抗体2A12和8H4对HPV18假病毒中和活性检测的浓度-抑制率曲线。具体实施方式1.免疫原的制备我们应用HPV18VLP包装载体,转染293TT细胞后，裂解细胞，成熟、包装并纯化得到HPV18VLP。2.小鼠免疫与抗血清的获得用50μgHPV18VLP蛋白与50μl弗氏完全佐剂的乳化混合物对6-8周龄Balb/c小鼠进行初免，在第21天、42天用25μgHPV18VLP蛋白与50μl弗氏不完全佐剂加强免疫2次，第2次加强免疫1周后，采血检测抗血清滴度；第2次加强免疫3周后进行冲击免疫，腹腔注射50μgHPV18VLP，3天后，取小鼠脾脏进行杂交瘤电融合。抗血清效价通过ELISA检测，用浓度为0.2μg/ml的HPV18VLP蛋白包被检测板，每孔加入梯度稀释的抗血清或者纯化的抗体100μl(对照为免疫前小鼠血清)，37℃孵育1.5h，洗涤2次，每孔加入1：10000稀释的辣根过氧化物酶标记的Goatanti-mouseIgG(H+L)二抗，37℃孵育1h，洗涤4-6次后，加100μlTMB底物，37℃孵育10min，50μl0.2M的H2SO4中止反应，测定OD450nm。ELISA检测血清效价规定为在OD450是空白对照的2.1倍以上并且大于0.2的最高稀释倍数。结果如图1所示，3免后5只小鼠血清效价均≥1.09X106,可见该抗原可诱导小鼠产生特异性针对HPV18VLP蛋白的高滴度抗血清，其中M1号小鼠效价最高，为9.84X106。。3.杂交瘤的制备取效价最高的M1号小鼠，经腹腔注射50μgHPV18VLP进行冲击免疫，3天后，取小鼠脾脏细胞进行杂交瘤电融合。在无菌环境下，取小鼠脾脏，经红细胞裂解液裂解去除红细胞后，制成脾细胞悬液后与SP2/O细胞按照2：1比例混合，以电融合缓冲液洗涤后重悬于电融合缓冲液中。电融合完毕，静置5分钟后轻缓收集细胞于DMEM完全培养基中静置于37℃。10min后离心，500rpm室温离心5分钟，弃上清，加入HAT培养液(次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷)轻轻重悬细胞，将细胞铺于96孔板中，每孔200μL。4.筛选分泌抗HPV18VLP单克隆抗体的杂交瘤细胞融合后第7天，用间接ELISA法筛选杂交瘤细胞。选择OD较高的阳性克隆进行特异性检测及亚克隆化，并用梯度稀释法及有限稀释法连续克隆化2-3次，直至到100％细胞阳性率，最后获得两株稳定分泌抗HPV18VLP的单克隆抗体细胞株，命名为2A12及8H4(图2)。将克隆化好的细胞扩增培养后冻存于液氮。5.单克隆抗体的制备和纯化将2A12及8H4细胞株以1×106/只的量注入弗氏不完全佐剂预处理的雌性小鼠腹腔，7天左右待小鼠腹部膨大时抽取腹水。采用ProteinG亲和纯化方法纯化单克隆抗体，以SDS-PAGE测定单克隆抗体的纯度，纯度达到90％以上。以BCA法测定纯化抗体的浓度。6.本专利技术特异性抗体的特征分析1)免疫球蛋白亚型鉴定采用洛阳佰奥通实验材料中心的小鼠单克隆抗体亚型鉴定检测试剂盒，鉴定细胞株2A12、8H4分泌抗体亚型，结果如图3所示，为2A12为IgG1,8H4为IgG2b。2)序列测定<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种可结合HVP18的蛋白质，其特征在于，包括VH区和VL区，其中，/n所述VH区包括三个CDR区，序列分别为SEQ ID NO:5或11、SEQ ID NO:6或12以及SEQ IDNO:7或13；/n所述VL区包括三个CDR区，序列分别为SEQ ID NO:8或14、SEQ ID NO:9或15以及SEQ IDNO:10或16。/n

【技术特征摘要】
1.一种可结合HVP18的蛋白质，其特征在于，包括VH区和VL区，其中，
所述VH区包括三个CDR区，序列分别为SEQIDNO:5或11、SEQIDNO:6或12以及SEQIDNO:7或13；
所述VL区包括三个CDR区，序列分别为SEQIDNO:8或14、SEQIDNO:9或15以及SEQIDNO:10或16。


2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于，所述VH区序列如SEQID1或3所示，所述VL区序列如SEQIDNO:2或4所示。


3.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质为免疫球蛋白。

【专利技术属性】
技术研发人员：吴喜林，吴稚伟，黄碧莲，张豆豆，
申请(专利权)人：源道隆苏州医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32