可结合CD4的纳米抗体4NB334及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种可结合CD4的纳米抗体4NB334，包括3个互补决定区CDR1

【技术实现步骤摘要】
可结合CD4的纳米抗体4NB334及其应用


[0001]本专利技术涉及生物医药领域。更特别地，涉及一种可结合CD4的纳米抗体，还涉及所述纳米抗体在制备HIV感染或CD4阳性的T细胞肿瘤的治疗药物和诊断剂中的应用。

技术介绍

[0002]CD4是T细胞表面上表达的重要受体分子，但同时也是病毒例如HIV等攻击T细胞的靶点。报道，HIV主要通过包膜表面的糖蛋白gp120与宿主细胞表面的特定受体(例如CD4)接触而影响病毒进入细胞的过程。抑制gp120和CD4的结合，可以有效地抑制HIV
‑
1对宿主细胞的感染。另外，由于T细胞肿瘤也表达CD4。因此，可考虑以CD4为靶点，利用抗CD4抗体来治疗HIV感染或CD4阳性的T细胞肿瘤。
[0003]1993年，一种来源于骆驼科的新型天然抗体被发现。该抗体天然缺失轻链而只由重链组成，其重链包含两个恒定区(CH2和CH3)、一个铰链区和一个重链可变区(Variable heavy chain domain，VHH，即抗原结合位点)，该重链可变区的相对分子质量约为13KDa，仅为常规抗体的1/10，且分子高度和直径均在纳米级别，是目前可获得的最小的功能性抗体片段，因此又被称为纳米单抗(Nanobody，Nb)。因纳米单抗稳定性高(90℃条件下仍不会降解)、亲和力高、与人源抗体同源性超过80％、毒性和免疫原性均较低等特点，最近纳米单抗被广泛用于免疫诊断试剂盒研发、影像学研发以及针对肿瘤、炎症、传染病和神经系统疾病等领域的抗体药物研发。
[0004]我们期望通过新的技术手段，筛选出获得能够结合CD4的抗体，为预防和治疗CD4相关疾病例如HIV感染或CD4阳性T细胞肿瘤等提供潜在新药。

技术实现思路

[0005]本专利技术通过用抗原免疫骆驼，获取骆驼源纳米单抗及其VHH，用于治疗HIV感染的病人。基于这些研究，本专利技术提供了一种可结合CD4的纳米抗体，其特征在于，包括3个互补决定区CDR1
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3，序列如SEQ ID NO:1
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3所示。
[0006]在一个具体实施方案中，所述纳米抗体还包括4个框架区FR1
‑
4，所述FR1
‑
4与所述CDR1
‑
3按顺序交错排列。例如，可将FR1
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4序列设计为如SEQ ID NO:4
‑
7所示(羊驼源)，但本专利技术的范围不限于此。抗体的特异性识别和结合能力主要由CDR区序列决定，FR序列影响不大，可根据物种来设计，这是本领域公知的。可设计人源、鼠源或骆驼源的FR区序列来连接上述CDR，从而得到一个可结合CD4的纳米抗体。
[0007]在一个具体实施方案中，所述纳米抗体为骆驼源的VHH或人源化的VHH。
[0008]本专利技术还提供了上述纳米抗体在制备CD4检测剂中的应用。
[0009]本专利技术还提供了上述纳米抗体在制备HIV或CD4阳性的T细胞肿瘤的治疗药物中的应用。
[0010]本专利技术还提供了上述纳米抗体在制备针对HIV或CD4阳性的T细胞肿瘤的CAR
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T治疗剂中的应用。
[0011]本专利技术还提供了编码上述纳米抗体的核酸。
[0012]本专利技术还提供了上述核酸在制备HIV感染或CD4阳性的T细胞肿瘤的治疗药物中的应用。
[0013]本专利技术针对HIV进行纳米抗体药物开发，通过制备CD4蛋白、免疫双峰骆驼、利用噬菌体库展示纳米单抗的平台技术等，筛选到特异性结合CD4的纳米抗体VHH，鉴定了其CDR序列，并构建了人源化的VHH
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huFc1；同时利用假病毒中和实验评估4NB在治疗HIV感染的疗效。本专利技术利用CD4结合的纳米抗体为HIV感染的临床治疗以及CD4淋巴瘤的临床治疗提供潜在的纳米抗体新药，双靶向抗体新药，基因治疗新药以及CAR细胞治疗等。
附图说明
[0014]图1为CD4第3和4次免疫羊驼一周后的抗血清效价检测曲线；
[0015]图2为不同稀释度的第4次免疫骆驼一周后的抗血清抑制HIV假病毒体外感染ghost细胞的曲线，以免疫前的血清为对照；
[0016]图3为CD4
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VHH噬菌体抗体文库为模板扩增的PCR产物的电泳图；
[0017]图4为CD4
‑
VHH噬菌体抗体文库的淘选鉴定，其中，A为噬菌体文库针对CD4蛋白淘选后ELISA检测统计图；B为从第二轮(2
nd
)和第三轮(3
rd
)淘选后的噬菌体抗体文库各挑选40个和46个克隆进行噬菌体ELISA检测统计图；
[0018]图5为抗体4NB334中和HIV假病毒感染实验统计图，JRFL为HIV假病毒，MuLv为无关对照病毒，X轴为抗体浓度，Y轴为病毒的相对抑制率。
具体实施方式
[0019]1.免疫原的制备
[0020]我们依据CD4蛋白序列和基因序列信息，分析并设计了可有效诱导骆驼产生针对CD4蛋白的特异性抗体的多肽CD4，在C端连接His
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tag(CD4
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his)或兔Fc(CD4
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rFc)用于后续纯化及检测。
[0021]2.羊驼免疫与抗血清的获得
[0022]用250μg CD4
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rFc蛋白与250μl弗氏完全佐剂的乳化混合物对羊驼进行初免，在第14天、28天、42天用CD4
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rFc蛋白与250μl弗氏不完全佐剂加强免疫3次，第2次和第3次免疫1周后，采血检测抗血清滴度；第4次免疫1周后，采血200ml用于噬菌体抗体库的构建。
[0023]抗血清效价通过ELISA检测，用浓度为0.5μg/ml的CD4
‑
his蛋白包被检测板，每孔加入梯度稀释的抗血清或者纯化的抗体100μl(对照为免疫前骆驼血清)，37℃孵育1.5h，洗涤2次，每孔加入1：10000稀释的辣根过氧化物酶标记的Goat anti
‑
Llamma IgG(H+L)二抗，37℃孵育1h，洗涤4
‑
6次后，加100μl TMB底物，37℃孵育10min，50μl 0.2M的H2SO4中止反应，测定OD 450nm。ELISA检测血清效价规定为在OD450是空白对照的2.1倍以上并且大于0.2的最高稀释倍数。
[0024]结果如图1所示，3免和4免的抗血清效价分别为3.28
×
106和9.84
×
106。由此可见，该抗原可诱导骆驼产生特异性针对CD4蛋白的高滴度抗血清。
[0025]为了进一步验证该高滴度的骆驼抗血清是否能有效阻止HIV病毒感染，进行病毒感染的中和实验。将不同稀释浓度的抗血清和免疫前血清分别与HIV病毒共同孵育60min，
随后转移到ghost细胞，48h后通过Glo Max化学发光酶标仪(Promega)检测病毒载量并计算本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种可结合CD4的纳米抗体，其特征在于，包括3个互补决定区CDR1
‑
3，序列如SEQ ID NO:1
‑
3所示。2.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体还包括4个框架区FR1
‑
4，所述FR1
‑
4与所述CDR1
‑
3按顺序交错排列。3.根据权利要求2所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体为骆驼源的VHH或人源化的VHH。4.权利要求1
‑
3中任一...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴稚伟，徐士杰，吴喜林，
申请(专利权)人：源道隆苏州医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：