可结合BCMA的纳米抗体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种抗BCMA纳米抗体，包括3个互补决定区CDR1

【技术实现步骤摘要】
可结合BCMA的纳米抗体及其应用


[0001]本专利技术涉及生物医药领域。更特别地，涉及一种可结合BCMA的纳米抗体，以及所述纳米抗体在制备BCMA检测剂或B细胞淋巴瘤治疗药物中的应用。

技术介绍

[0002]BCMA是B细胞成熟抗原，是一种跨膜糖蛋白，亦称CD269或TNFRSF17，是TNF受体超家族成员之一，它的配体是B细胞激活因子(BAFF)以及增殖诱导配体(APRIL)。BCMA的表达限于B细胞谱系，主要存在于浆细胞和浆母细胞上，研究表明，BCMA mRNA和蛋白在恶性浆细胞上的表达远高于正常浆细胞，而在初始B细胞和记忆B细胞及其他正常组织细胞上不表达。BAFFF及APRIL通过BCMA的信号传导促进恶性浆细胞的存活。此外，有研究表明，在供体淋巴细胞输注与移植物抗肿瘤反应后缓解的多发性骨髓瘤患者中检测到BCMA抗体，以上研究结果表明，BCMA是非常有前景的B细胞淋巴瘤的靶向疗法抗原。
[0003]1993年，一种来源于骆驼科的新型天然抗体被发现。该抗体天然缺失轻链而只由重链组成，其重链包含两个恒定区(CH2和CH3)、一个铰链区和一个重链可变区(Variable heavy chain domain，VHH，即抗原结合位点)，该重链可变区的相对分子质量约为13KDa，仅为常规抗体的1/10，且分子高度和直径均在纳米级别，是目前可获得的最小的功能性抗体片段，因此又被称为纳米单抗(Nanobody，Nb)。因纳米单抗稳定性高(90℃条件下仍不会降解)、亲和力高、与人源抗体同源性超过80％、毒性和免疫原性均较低等特点，最近纳米单抗被广泛用于免疫诊断试剂盒研发、影像学研发以及针对肿瘤、炎症、传染病和神经系统疾病等领域的抗体药物研发。
[0004]治疗性抗体药物发展的趋势从鼠源、人鼠嵌合、人源化再到全人源，再到近年得到广泛关注的纳米抗体，纳米抗体的研发得到高速发展。2018年9月首个纳米抗体药物获批。目前国内外有多个纳米抗体药物在临床研究阶段。我们期望通过免疫羊驼，获得高亲和力的靶向BCMA的治疗性纳米抗体。

技术实现思路

[0005]本专利技术通过用抗原免疫羊驼，获取羊驼源纳米单抗及其VHH，用于诊断和治疗B细胞淋巴瘤病人。基于这些研究，本专利技术提供了一种可结合BCMA的纳米抗体，包括3个互补决定区CDR1
‑
3序列分别如SEQ ID NO:1
‑
3所示。
[0006]在一个具体实施方案中，所述纳米还包括4个框架区FR1
‑
4，所述FR1
‑
4与所述CDR1
‑
3交错排列。例如，可将FR1
‑
4序列设计为如SEQ ID NO:4
‑
7所示(羊驼源)，但本专利技术的范围不限于此。抗体的特异性识别和结合能力主要由CDR区序列决定，FR序列影响不大，可根据物种来设计，这是本领域公知的。可设计人源、鼠源或骆驼源的FR区序列来连接上述CDR，从而得到一个可结合BCMA的纳米抗体。
[0007]本专利技术还提供了上述纳米抗体在制备BCMA检测剂中的应用，该抗体即可检测游离的BCMA蛋白，也可检测细胞表面的BCMA蛋白。
[0008]本专利技术还提供了上述纳米抗体在制备B细胞淋巴瘤治疗药物中的应用。
[0009]本专利技术还提供了上述纳米抗体在制备针对B细胞淋巴瘤的CAR T治疗剂中的应用。
[0010]本专利技术还提供了编码上述纳米抗体的核酸。在一个实施方案中，所述核酸编码序列为DNA编码序列或RNA编码序列。
[0011]本专利技术针对B细胞淋巴瘤治疗药物进行纳米抗体药物开发和诊断试剂研发，通过制备sBCMA蛋白、免疫羊驼、利用噬菌体库展示纳米单抗的平台技术等，筛选到特异性结合sBCMA的纳米抗体VHH，鉴定了其CDR序列，并构建了人源化的VHH
‑
huFc1；同时利用流式细胞术评估人源化抗体与细胞表面BCMA蛋白的结合。本专利技术为B细胞淋巴瘤的临床治疗提供潜在的纳米抗体新药,同时为B细胞淋巴瘤患者的诊断提供相应的检测试剂。
附图说明
[0012]图1为sBCMA第3和4次免疫羊驼一周后的抗血清效价检测曲线；
[0013]图2为以sBCMA
‑
VHH噬菌体抗体文库为模板扩增的PCR产物的电泳图；
[0014]图3为sBCMA
‑
VHH噬菌体抗体文库的淘选鉴定，其中，A为噬菌体文库针对BCMA蛋白淘选后ELISA检测统计图；B为从第二轮(2
nd
)、第三轮(3
rd
)和第四轮(4
th
)淘选后的噬菌体抗体文库分别挑选48、46和47个克隆进行噬菌体ELISA检测统计图；
[0015]图4为BANB0352抗体分别与细胞表面表达的人BCMA或猴BCMA膜蛋白结合的流式检测结果。
具体实施方式
[0016]1.免疫原的制备
[0017]我们依据NCBI网站上人BCMA蛋白序列和基因序列信息，分析并设计了可有效诱导羊驼产生针对BCMA蛋白的特异性抗体的多肽sBCMA，在C端连接His
‑
tag(sBCMA
‑
his)或兔Fc(sBCMA
‑
rFc)用于后续纯化及检测。
[0018]2.羊驼免疫与抗血清的获得
[0019]用250μg sBCMA
‑
rFc蛋白与250μl弗氏完全佐剂的乳化混合物对羊驼进行初免，在第14天、28天、42天用sBCMA
‑
rFc蛋白与250μl弗氏不完全佐剂加强免疫3次，第3次和第4次免疫1周后，采血检测抗血清滴度；第4次免疫1周后，采血100ml用于噬菌体抗体库的构建。
[0020]抗血清效价通过ELISA检测，用浓度为0.5μg/ml的BCMA蛋白包被检测板，每孔加入梯度稀释的抗血清或者纯化的抗体100μl(对照为免疫前羊驼血清)，37℃孵育1.5h，洗涤2次，每孔加入1：10000稀释的辣根过氧化物酶标记的Goat anti
‑
Llamma IgG(H+L)二抗，37℃孵育1h，洗涤4
‑
6次后，加100μl TMB底物，37℃孵育10min，50μl 0.2M的H2SO4中止反应，测定OD 450nm。ELISA检测血清效价规定为在OD450是空白对照的2.1倍以上并且大于0.2的最高稀释倍数。
[0021]结果如图1所示，3免和4免的抗血清效价分别为1.09
×
106和3.28
×
106。由此可见，该抗原可诱导羊驼产生特异性针对BCMA蛋白的高滴度抗血清。
[0022]3.VHH噬菌体库构建及淘选
[0023]收集100ml免疫后羊驼的外周血，利用淋巴细胞分离液(GE Ficoll
‑
Paque Plus)分离获得羊驼的PBMC，根据TRIzol操作手册，提取RNA，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种可结合BCMA的纳米抗体，其特征在于，包括3个互补决定区CDR1
‑
3序列分别如SEQ ID NO:1
‑
3所示。2.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体还包括4个框架区FR1
‑
4，所述FR1
‑
4与所述CDR1
‑
3按顺序交错排列。3.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体为羊驼源的VHH或人源化的VHH...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐士杰，吴稚伟，吴喜林，
申请(专利权)人：源道隆苏州医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：