一种识别HBsAg变异株的人鼠嵌合全分子IgG抗体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种识别HBsAg变异株的人鼠嵌合全分子IgG抗体及其应用，其轻链可变区的核酸序列为SEQ ID NO.1所示；所述的重链可变区的核酸序列为SEQ ID NO.2所示，本发明专利技术还公开了上述全分子IgG抗体的DNA分子、表达载体、宿主细胞和应用，属于生物制药领域。本发明专利技术使用天然野生型重组HBsAg蛋白免疫小鼠，采用HBsAg变异株进行多次筛选，通过杂交瘤技术制备鼠源HBsAg变异株单克隆抗体，并采用基因工程技术和抗体工程技术，制备重组人鼠嵌合抗HBsAg变异株全分子IgG。该嵌合抗体可有效识别多种HBsAg变异株，并有效用于HBsAg变异株的检测及用于免疫被动保护人体不被HBV变异株感染。

A human mouse chimeric whole molecule IgG antibody to recognize HBsAg mutant and its application

【技术实现步骤摘要】
一种识别HBsAg变异株的人鼠嵌合全分子IgG抗体及其应用
本专利技术属生物制药领域，具体涉及一种识别HBsAg变异株的人鼠嵌合全分子IgG抗体及其应用。
技术介绍
单克隆抗体技术已在诊断和治疗等发挥巨大的作用，极大提高了医疗技术水平，常规的鼠或其它动物来源抗体因其来源可引起很强的异种免疫反应，在人体应用受到很大限制。目前针对乙型肝炎病毒的临床应用广泛应用的是高效免疫球蛋白(hepatitisBimmunoglobulin，HBIg)，其来自志愿者疫苗免疫后产生抗体应答，再采集血浆进行抗体浓缩纯化，HBIg的应用对保护易感者起到了极大作用，在肝移植中防止HBV再感染起重要作用。然而，由于HBV的其复制过程中涉及逆转录过程，使得其易发生变易，特别在疫苗接种、HBIg的广泛使用的免疫压力筛选下，大量HBV变异株已屡见不鲜，疫苗接种、HBIg的失保护也不断的发生，且呈现逐年上升。研究专利技术新的保护方法和制品十分重要。人源化抗体技术也已日渐成熟，已是改变抗体分子本身免疫原性和功能特征的重要方法，同时保持其特定识别特异性。目前已公布的以乙肝表面抗原(HepatitisBSurfaceAntigen，HBsAg)相关抗体多以小鼠为主，多用于临床检测开发，也有部分涉及能识别HBV变异株。本专利技术所制备的抗体，可有效与多种HBV变异株相结合，显示了良好的中和特性，且尚无相关功能的抗变异HBsAg抗体的专利报道。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种识别HBsAg变异株的人鼠嵌合全分子IgG抗体及其应用，以及该抗体CDR区域的核酸及氨基酸序列，抗体可变区核酸及氨基酸序列，抗体全分子氨基酸序列，抗原结合表位氨基酸序列，制备鼠源源抗HBsAg抗体的方法，人鼠嵌合抗HBsAg全分子IgG的方法，及其对识别不同HBV变异株的能力及用途。一种识别HBsAg变异株的人鼠嵌合全分子IgG抗体，包括轻链可变区和重链可变区，所述的轻链可变区的三个抗原互补区CDR的氨基酸序列分别为SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.7所示；所述的重链可变区的三个抗原互补区CDR的氨基酸序列分别为SEQIDNO.8、SEQIDNO.9、SEQIDNO.10所示。所述的HBsAg变异株为118Met、120Thr、123Ala、126Asn、130Arg、141Leu、142Ser、143Leu、145Arg、146Ser、154Thr、181Thr、204Ile、204Val中的一种或多种。所述的HBsAg变异株为118Met、123Ala、130Arg、142Ser、145Arg、154Thr中的一种或多种。进一步的，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO.3所示；且所述的重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。一种核酸分子，其编码权利要求以上任一所述的全分子IgG抗体的重链和轻链。进一步的，所述轻链氨基酸序列为SEQIDNO.11所示，所述的重链氨基酸序列为SEQIDNO.12所示。进一步的，所述的轻链可变区的核酸序列为SEQIDNO.1所示；所述的重链可变区的核酸序列为SEQIDNO.2所示。一种表达载体，包含有以上任一所述核酸分子以及与该核酸分子操作性相连的表达调控序列。一种宿主细胞，被所述的表达载体转化。一种全分子IgG抗体在制备HBV诊断试剂或治疗药物中的应用，所述的全分子IgG抗体为所述的全分子IgG抗体。本专利技术的有益效果为：本专利技术制备的人鼠嵌合全分子IgG抗体可有效识别多种HBsAg变异株，并有效用于HBsAg变异株的检测及用于免疫被动保护人体不被HBV变异株感染，并有效用于HBsAg变异株的检测及用于免疫被动保护人体不被HBV变异株感染，在被动免疫保护中针对主要变异株免疫逃避有着良好应用前景。附图说明图1为酶联免疫吸附实验；图2为SDS-PAGE检测；其中，M：ProteinMarker1:293F细胞培养上清2：纯化洗脱液3：纯化流穿液图3为HBV感染细胞株Western-blot检测；其中，1：HepaG2.2.15细胞；2：HepaG2；M：ProteinMarker图4为变异表达株Western-blot检测；其中，N为pJW4303质粒转染产物，1-7分别为：pJW4303-HBsAg-118、123、130、142、145、154、Wild质粒转染产物图5为BiacoreT100抗体亲和力检测；其中，从上往下的曲线依次代表Run4、Run5、Run3、Run1、Run2图6为检测HBsAg变异株能力验证结果。具体实施方式1.鼠源抗HBsAg杂交瘤细胞的培养和准备2.鼠源抗HBsAg抗体序列的扩增、测序、分析和鉴定3.人鼠嵌合抗HBsAg全分子IgG的制备、表达及纯化4.人鼠嵌合抗HBsAg全分子抗体的特性分析5.抗HBsAg全分子IgG对多种变异株的识别能力实施例1.鼠源抗HBsAg杂交瘤细胞的培养和准备采用已制备的鼠源抗HBsAg杂交瘤细胞，该杂交瘤细胞已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCNO:C2014151。常规收获小鼠腹腔巨噬细胞为饲养细胞，37℃水浴锅中解决冻存杂交瘤细胞细胞株，缓慢加入10倍体积完全培养基，500g离心5分钟，去除上清，加入含10％胎牛血清的高糖DMEM完全培养基，5％的CO2、37℃细胞培养箱培养，隔天换液，收集足量细胞备用。同时使用美国Sigma公司的单克隆抗体亚型鉴定试剂盒(ISO-2KT)进行抗体的亚型，结果示抗HBsAg抗体亚型为Ig2a。实施例2.鼠源抗HBsAg抗体序列的扩增、测序、分析和鉴定将提取杂交瘤细胞的RNA，扩增抗体基因，胶回收目的条带，进行测序并分析结果。具体方法如下：1、RNA提取采用Qiagen的RNeasyPlusMiniKit进行RNA提取(货号为：74134)，具体操作流程，如下：1)取培养的杂交瘤细胞计数，取1×107，300g×5min去上清液，收集细胞。2)加入600μlbufferRLTplus，裂解细胞。3)用枪进行反复吹打，匀质。4)将匀质液转入基因组去除柱中，8000g×30s，留取过滤液。5)加入600μl的70％乙醇，反复吹打混匀。6)将液体移入Rneasy柱中，8000g×15s，弃滤液。7)加入700ulRW1buffer，8000g×15s，弃滤液。8)加入500ulRPEbuffer，8000g×15s，弃滤液。9)加入500ulRPEbuffer，8000g×2min，弃滤液。10)换新的1.5mlep管，全速离心1min。11)加入30ul的RNase-freewater，8000g×1min洗脱。2、反转录采本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种识别HBsAg变异株的人鼠嵌合全分子IgG抗体，其特征在于，所述抗体的轻链可变区的三个抗原互补区CDR的氨基酸序列分别为SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7所示；所述抗体的重链可变区的三个抗原互补区CDR的氨基酸序列分别为SEQ ID NO.8、SEQID NO.9、SEQ ID NO.10所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种识别HBsAg变异株的人鼠嵌合全分子IgG抗体，其特征在于，所述抗体的轻链可变区的三个抗原互补区CDR的氨基酸序列分别为SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.7所示；所述抗体的重链可变区的三个抗原互补区CDR的氨基酸序列分别为SEQIDNO.8、SEQIDNO.9、SEQIDNO.10所示。


2.根据权利要求1所述的全分子IgG抗体，其特征在于，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO.3所示；且所述的重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。


3.根据权利要求1所述的全分子IgG抗体，其特征在于，所述的HBsAg变异株为118Met、120Thr、123Ala、126Asn、130Arg、141Leu、142Ser、143Leu、145Arg、146Ser、154Thr、181Thr、204Ile、204Val中的一种或多种。


4.根据权利要求3所述的全分子IgG抗体，其特征在于，所述的HBsAg变异株...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨永林，申玉英，傅强，冯振卿，唐奇，
申请(专利权)人：南京市第一医院，
类型：发明
国别省市：江苏;32