抗乙型肝炎病毒表面抗原前S1抗原的纳米抗体及其用途制造技术

本发明专利技术公开了抗乙型肝炎病毒表面抗原前S1抗原(HBV‑preS1)的纳米抗体。本发明专利技术通过用HBV‑preS1免疫羊驼，筛选得到了抗HBV‑preS1的纳米抗体。本发明专利技术还涉及这些抗体的片段及与Fc融合组成的完整抗体，该抗体用于乙型肝炎病毒及肝癌的治疗，和制备该抗体的方法。

Nano antibody against PreS1 antigen of hepatitis B surface antigen and its application

【技术实现步骤摘要】
抗乙型肝炎病毒表面抗原前S1抗原的纳米抗体及其用途
本专利技术涉及抗体药物
，尤其涉及抗乙型肝炎病毒表面抗原前S1抗原(HBV-preS1)的纳米抗体序列。该专利技术用于诊断或治疗乙型肝炎病以及肝癌的用途。
技术介绍
本专利技术涉及抗乙型肝炎病毒表面抗原前S1抗原(HBV-preS1)的纳米抗体，该专利技术用于诊断或治疗乙型肝炎病以及肝癌。经过三十多年的发展，治疗性单克隆抗体药物在肿瘤及自身免疫病领域已经取得了重大进展，现成为临床治疗此类疾病的重要手段之一。发展针对HBV的治疗性抗体，有望为慢性HBV感染提供新的治疗策略。乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus，HBV)的感染是全球共同面临的严重的公共卫生问题。统计结果显示，全球有超过20亿人感染过HBV，其中约有3.5亿人为慢性HBV感染(ChronichepatitisB，CHB)。由于HBV感染的感染率极高，并且由慢乙肝患者发展成的肝癌死亡率在我国癌症总死亡率中排名第二，因此乙型肝炎对我国造成了严重的经济负担。HBV的感染在各个国家及地区存在极大的的差异，大部分乙肝携带者集中在亚洲、非洲和西太平洋地区。因此乙型肝炎病毒感染，并由其所引发的一系列肝炎、肝硬化及肝癌等肝脏疾病已成为全世界公共健康问题之一。因此HBV感染，尤其是慢性HBV感染，造成的慢性肝炎、肝硬化和原发性肝癌等肝脏疾病给患者带来沉重的经济负担。目前已经批准的应用于慢乙肝临床治疗的药物有干扰素和核苷类似物两类，尽管在抑制病毒复制和延缓疾病进展上起到积极的效果，但仍然存在治疗周期长、应答率低、副反应较严重(干扰素类)以及潜在耐药性(核苷类似物)等问题，因此，急需发展基于新靶点或新机制的抗HBV药物。HBV基因组大小为3.2kb碱基对(basepair，bp)的小环形DNA(3182～3221,不同亚型的HBV病毒基因组长度略有差别)，是目前已知最小的真核细胞DNA病毒之一。HBV基因组有4个开放阅读框(Openreadingframe，ORF)：S-ORF、P-ORF、C-ORF、X-ORF。S-ORF编码三个包膜蛋白SHBs(S)、MHBs(preS2+S)和LHBs(preS1+preS2+S)。C-ORF有前C区(preC)和C基因区，前者是一种分泌型蛋白(HBeAg)，对于慢性感染免疫耐受的形成具有重要的作用，后者组成病毒Capsid，并包裹病毒基因组，HBV基因组中的这一区段最保守，是免疫攻击的靶表位。X-ORF的基因产物HBx蛋白具有转式激活增强子和启动子的转录功能，是一种多功能的反式调节因子，与病毒感染、转录、复制、细胞凋亡和HCC发生均有重要联系。P-ORF是HBV基因组中最长的ORF，负责转录DNA聚合酶。此外，HBV的各个开放阅读框高度重叠，具有非常紧致的结构。HBV基因组含4个基因，转录出4种不同的mRNA并可以编码合成9种不同的病毒蛋白，包括组装病毒的外膜蛋白(L-HBsAg，M-HBsAg，S-HBsAg)和核壳(HBcAg)的结构蛋白；3种P蛋白(末端蛋白，DNAp和RNA酶H)和调节病毒复制功能的HBx蛋白,另一种pc/C基因编码的HBeAg蛋白也一种是功能蛋白。乙型肝炎病毒外膜蛋白(HBsAg)又称为澳大利亚抗原，最早是由Blumberg在1965年发现，而且被广泛应用于定量血清中HBsAg的值来预测病人HBV感染水平。HBV的外膜蛋白由S-ORF编码合成，包括L-HBsAg，M-HBsAg和S-HBsAg3种外膜成分，3种蛋白有各自的起始密码，但共同合用S-HBsAg的终止密码。HBV的核心蛋白由C-ORF编码(nucleprotein)，有2中形式：一种为病毒核壳的结构成分HBcAg；另一种是可溶性、能分泌的HBeAg。HBV的C基因有2个相关的ORF，其中以两个起始密码子区分为前C(Pre-C)和C区，但是有共同的终止密码子。Pre-C/PmRNA合成P21的核壳蛋白HBcAg，Pre-C-mRNA产生P25Pre-C蛋白，经一系列处理最终才成为HBeAg。HBcAg在不同细胞系中，如细菌、酵母、哺乳动物细胞等，在无其他HBV相关蛋白或元件的情况下均能自发组装成Capsid结构，可以作为基因工程疫苗的载体。据卫生部公布的《传染病2011年疫情分布报告》显示：在我国肝病患者已经突破1.5亿人，其中慢性乙型肝炎患者已达到4000-5000万人，慢性HBV感染的主要不良结局包括罹患肝硬化(LC)、原发性肝细胞癌(HCC)等终末期肝脏疾病(ALD)，研究表明慢性乙肝患者最终由20％-30％发展成为肝硬化。目前我国肝硬化患者约为3000万，其中4.7％的肝硬化患者最终会转化为肝癌，每年约有30万人死于肝癌，我国已经成为肝病发生大国。肝癌发生的最主要危险因素是慢性HBV感染。近年来研究发现，病毒可能作为诱变剂起直接作用，科研工作者们已从越来越多的HCC病例中发现了病毒DNA序列整合到潜在的致癌基因上。一些其他因素也与慢乙肝患者的HCC发生风险相关，其中包括酒精、代谢因素和环境因素(如黄曲霉素)等。目前人类主要是以预防性的疫苗为主作为对付HBV的策略，但是对于那些慢乙肝患者，需要寻找有效的抗病毒药物。在过去的20年间七种药物已经被FDA批准用来治疗慢性乙型肝炎，治疗乙肝最早的两个药物是干扰素(Interferon-alfa-2b)和拉米夫定(Lamivudine)，他们在上世纪90年代得到了很好的应用。本世纪初，FDA批准上市了五种药物用于乙肝的治疗，他们分别是：阿德福韦酯(adefovirdipivoxil),干扰素(alfa-2apeginterferonalfa-2a),替诺福韦酯(tenofovirdisproxilfumarate)，恩替卡韦(entecavir),替比夫定(telbivudine)。单域抗体(singledomainantibody,SDAb)单域抗体又称纳米抗体(nanobody)或重链抗体(heavychainantibody，hcAb)，最早是从骆驼科动物(羊驼)分离出的一种突变形式的抗体，分子量非常小只有12-15kDa，只有传统抗体分子量的的1/12左右。单域抗体，仅由重链构成，无轻链，与传统抗体的组成结构不同，其Fab区仅是一个单结构域，通过铰链区与Fc区连接。单域抗体构象稳定水溶性好，在胃液和内脏中仍能与抗原高亲和力结合。单域抗体分子量小，所以能识别某些独特的抗原表位，例如可进入酶的活性部位或者进去细菌或病毒表面受体的裂缝中，可以利用其模拟药物来设计小分子受体的激动剂、酶的抑制剂或拮抗剂等。
技术实现思路
本专利技术通过用HBV-preS1抗原免疫羊驼，收集分离免疫后的PBMC，提取总RNA并得到cDNA,通过噬菌体展示技术获得了抗体库，进一步使用HBV-preS1筛选得到与其特异反应的纳米抗体。本专利技术制备的针对HBV表面抗原前S1抗原的纳米抗体，并公开了其组成抗体的CDR1、CDR2、CDR3序列，该纳米抗体能够与HBV-preS1特异反应，并且能够在细胞模型及小鼠体内本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗乙型肝炎病毒表面抗原前S1抗原(HBV-preS1)的纳米抗体及抗体片段，该抗体氨基酸序列包含有CDR1，CDR2，CDR3三个氨基酸序列区域，该抗体用于乙型肝炎病毒及肝癌的诊断和治疗。/n

【技术特征摘要】
1.一种抗乙型肝炎病毒表面抗原前S1抗原(HBV-preS1)的纳米抗体及抗体片段，该抗体氨基酸序列包含有CDR1，CDR2，CDR3三个氨基酸序列区域，该抗体用于乙型肝炎病毒及肝癌的诊断和治疗。


2.根据权利要求1所述的分子，其特征在于，所述抗体是抗乙型肝炎病毒表面抗原前S1抗原(HBV-preS1)的抗体。


3.根据权利要求1所述的分子，其特征在于，所述抗体是纳米抗体，也被称为单域抗体或重链抗体。


4.根据权利要求1所述的分子，其中所述抗体片段可以与Fc组合形成完整抗体。


5.根据权利要求1所述的分子，其中所述抗体片段可以与其他抗体组合形成双特异抗体或多特异抗体。


6.根据权利要求1所述的分子，其特征在于，所述纳米抗体与毒素、放射性核素组合构成的抗体药偶联物。


7.根据权利要求1所述的分子，其特征在于，所述抗体用于乙型肝炎病毒的诊断和治疗。


8.根据权利要求1所述的分子，其特征在于，所述抗体用于肝癌的诊断和治疗。


9.根据权利要求1所述的分子，其特征在于，包含有抗体CDR1，CDR2，CDR3序列。


10.该抗体CDR1序列可以为SEQIDNO：1至SEQIDNO：12任何一种序列组成。


11.该抗体CDR2序列可...

【专利技术属性】
技术研发人员：张军方，
申请(专利权)人：深圳市因诺赛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44