本发明专利技术涉及ELISA方法定量测定人血清中重组人鼠嵌合抗CD20单克隆抗体浓度。具体而言，本发明专利技术提供测定血清中抗CD20单克隆抗体浓度的酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，所述方法使用抗CD20单克隆抗体的F(ab′)2片段免疫动物获得的多克隆抗体作为捕获抗体，使用IgG-F(ab′)2抗体作为检测抗体。本发明专利技术的方法具有良好的特异性、反复冻融稳定性、长期冻存稳定性等优点。
【技术实现步骤摘要】
ELISA方法定量测定人血清中重组人鼠嵌合抗CD20单克隆 抗体浓度
本专利技术涉及定量测定血清中单克隆抗体药物浓度的方法。本专利技术的方法采用酶联 免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法对血清中抗CD20单克隆抗体 浓度进行分析，具有良好的灵敏度和特异性等优点。
技术介绍
非霍奇金淋巴瘤（NHL)是最常见的淋巴组织恶性肿瘤，其死亡率在我国居恶性肿 瘤中的第十位。NHL的传统治疗方案是以化疗为主，局部放疗、手术治疗为辅的综合治疗。 迄今为止，传统细胞毒化疗药物进一步提高恶性淋巴瘤临床疗效的空间十分有限，单克隆 抗体已经成为对经过选择的NHL患者较为成功的一种治疗方法。治疗B细胞性NHL最常用 的抗体靶目标包括⑶20、⑶22等。 ⑶20抗原位于前B和成熟B淋巴细胞的表面，而造血干细胞、正常浆细胞或其它 正常组织不表达⑶20。95%以上的B细胞型非霍奇金淋巴瘤瘤细胞表达⑶20。重组人鼠 嵌合抗CD20单克隆抗体与B细胞表面的CD20抗原特异性结合后，启动介导B细胞溶解的 免疫反应，作用机制包括补体依赖的细胞毒作用（CDC)、抗体依赖的细胞毒作用（ADCC)、生 长抑制作用等[1_2]。因此，⑶20抗原是靶向治疗非霍奇金淋巴瘤的有效靶点。国外同类品 种利妥昔单抗注射液（英文名称：Rituximab Injection ;商品名称：RiUixmi t利妥昔单抗 (商品名：美罗华））由IDEC/Genentech公司开发，于1997年11月获美国FDA批准用于NHL 治疗，1998年欧盟也批准该药上市。利妥昔单抗注射液于2000年3月在我国获得进口许 可。利妥昔单抗注射液上市规格为500mg/50ml、100mg/10ml，临床治疗NHL使用推荐剂量为 375mg/m2BSA (体表面积）。 神州细胞工程有限公司研制的重组人鼠嵌合抗⑶20单克隆抗体SCT400是一种人 鼠嵌合IgGl型抗CD20单克隆抗体，能特异性地与跨膜抗原CD20结合，临床上拟单用或与 化药联合治疗非霍奇金淋巴瘤（NHL)。SCT400抗原结合位点和抗体可变区氨基酸序列与利 妥昔单抗完全相同，恒定区与利妥昔单抗在重链CHl区域仅有一个氨基酸差异（V219A)已 经开展了针对SCT400和利妥昔单抗在质量、临床前药效、安全性评价等方面的比较研究工 作。研究结果证明二者的理化特性、生物活性、体内外药效和药代动力学特征基本一致；临 床前安全性评价结果也证实二者具有高度相似和可比性。基于以上临床前数据和临床研 究，在中国医学科学院肿瘤医院和307医院展开了多中心、开放I期临床药代动力学试验。 目前目前已经由多篇文献报道应用ELISA的方法检测人血清中利妥昔单抗的浓 度[Maloney et al, 1994 ；Berinstein et al, 1998 ；Tobinai et al, 1998 ；Iacona et al, 2000，Buem et al，2004;Cragg et al，2004;Hampson et al，2010]。但文献报道的多克隆 抗体，如纯化的多克隆羊抗IDEC C2B8抗体血清、羊抗人IgG结合辣根过氧化氢酶、商品化 的兔抗鼠 IgG或者是过氧化氢酶标记的羊抗鼠 IgG被用于一系列利妥昔单抗的临床研究 中，但是在这些临床研究中样本检测前需要稀释1/20000倍以上因为缺少特异性，且与正 常人IgG有交叉反应。因为这个原因，Cragg提出了使用特异的mAb MB2A4直接检测利妥 昔单抗的浓度，这种分析方法呈现出高的特异性，但是需要进行高通量筛选、费用昂贵因此 很难被广泛运用。并且这种抗独特性抗体只能检测游离的利妥昔单抗的浓度不能检测循环 的⑶20-利妥昔单抗的混合浓度。 参考文献 Anderson KC，Bates MP，Slaughenhoupt BL，Pinkus GS，Schlossman SF，Nadler LM. 1984. Expression of human B cell associated antigens on leukemias and lymphomas ：A model of human B cell differentiation. Blood ；63 :1424-33. Berinstein，N. L.，Grillo-Lopez，A. J.，White，C. A.，Bence-Bruckler，I.， Maloney，D.，Czuczman，M.，Green，D.，Rosenberg，J.，McLaughlin，P.，Shen，D.，1998. Association of serum rituximab (IDEC-C2B8)concentration and anti-tumor response in the treatmentof recurrent low-grade or follicular non-Hodgkin' s lymphoma. Ann. Oncol. 9,995-1001. Beum,P. V. ,Kennedy,A. D. ,Taylor,R.P. ,2004. Three new assays for rituximab based on its immunological activity or antigenic properties !analyses of sera and plasmas of RTX-treated patients with chronic lymphocytic leukemia and other B cell lymphomas. J. Immunol. Meth. 289,97-109. Cartron G，Blasco H，Paintaud G，Watier H，Le Guellec C. . Pharmacokinetics of rituximab and its clinical use !thought for the best use ? Crit Rev Oncol Hematol. 2007,62(1) :43-52. Cragg，M. S.，Bayne，M. B.，Tutt，A. L.，French，R. R.，Beers，S.，Glennie，M. J.， Illidge,T. M. ,2004. A new anti-idiotype antibody capable of binding rituximab on the surface of lymphoma cells. Blood 104,2540-2542. Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation FDA. May 2001. Hampson G，Ward TH，Cummings J，Bayne M，Tutt AL，Cragg MS，Dive C， Illidge TM. 2010. Validation of an ELISA f本文档来自技高网...
【技术保护点】
测定血清中抗CD20单克隆抗体浓度的酶联免疫吸附测定法，所述测定法使用抗CD20单克隆抗体的F(ab′)2片段免疫动物获得的多克隆抗体作为捕获抗体，使用IgG‑F(ab′)2抗体作为检测抗体。
【技术特征摘要】
1. 测定血清中抗CD20单克隆抗体浓度的酶联免疫吸附测定法，所述测定法使用 抗CD20单克隆抗体的F(ab ' )2片段免疫动物获得的多克隆抗体作为捕获抗体，使用 IgG-F (ab' ) 2抗体作为检测抗体。2. 权利要求1所述的测定法，其中所述多克隆抗体如下获得：使用胃蛋白酶消化抗 ⑶20单克隆抗体，去除Fc片段，收集F(ab' )2片段，优选对所述F(ab' )2片段进行纯化， 然后用于免疫动物，优选兔。3. 权利要求1-2任一项所述的测定法，其中包括在检测前对血清样品进行稀释的步 骤，优选稀释低于20000倍，例如稀释200至18000倍，300至15000倍，400至12000倍，500 至 10000 倍，600 至 8000 倍，700 至 6000 倍，800 至 3000 倍，900 至 2000 倍，950 至 1500 倍， 98...
【专利技术属性】
技术研发人员：石远凯，谢良志，韩晓红，盖文琳，宋媛媛，李丹，王寅，
申请(专利权)人：中国医学科学院肿瘤医院，神州细胞工程有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。