本发明专利技术公开了一种抗p185erbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体及其构建方法，利用PCR法扩增出抗人p185erbB2鼠源性单抗可变区基因(vH和vL)和人IgG1的恒定区基因(γ1和κ)，再采用三引物PCR法将vH和γ1，vL和κ进行拼接，得到嵌合重链(H)和嵌合轻链(L)基因，分别插入质粒pVAX1/IRES的IRES元件的上、下游，用内切酶将H-IRES-L从pVAX1/H-IRES-L上切下，插入慢病毒载体pWPI中，构建成慢病毒表达pWPI/H-IRES-L。经相应酶切和测序鉴定，与预期设计一致。转染293T细胞后，有嵌合重链和嵌合轻链基因的共同表达，而且嵌合抗体能够与p185erbB2分子特异性结合。本发明专利技术为今后抗p185erbB2工程抗体的研究奠定了基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及慢病毒表达载体，尤其是一种抗pl85MbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体及其构建方法。
技术介绍
C-erbB2/HER2/neu编码产物p 185ertB2是具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，属于表皮生长因子受体(EGFR)家族成员。C-erbB2/HER-2/neu基因的扩增和pl85eAB2蛋白的过度表达见于多种恶性肿瘤，包括乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、子宫内膜癌、胃癌、前列腺癌和肺腺癌。pl85OTbB2过度表达提示肿瘤预后差，如 转移、复发、易耐药及存活期短等。因此，pl85erbB2作为肿瘤抗原，是一个理想的肿瘤治疗靶点。1998年10月，美国食品及药物管理局(FDA)正式批准将一株抗pl85ertB2人源化抗体Trastuzumab (商品名Herceptin)用于临床治疗pl85MbB2高表达的转移性乳腺癌。但是，国外进口抗体药物价格昂贵，如何开发出拥有自主知识产权的抗pl85OTbB2基因工程抗体对于国内患者具有十分重要的实际意义，其中，表达载体构建尤为关键。目前对鼠单抗的人源化技术包括将鼠单抗恒定区替换为人的恒定区的嵌合抗体；将鼠单抗除互补决定区外的部分均替换为人的序列的改型抗体；将抗体片段进行改型的小片段抗体(包括=Fab片段、单链抗体和双链抗体等)；从抗库中直接筛选人抗体基因的抗体库技术。许多临床应用研究已经证明，大多数嵌合抗体在人体内只引起极弱的、甚至未引起HAMA反应，同时嵌合抗体较改型抗体和小分子抗体能更好地保持亲本鼠单抗的亲合力和特异性，而且构建表达技术较改型抗体和噬菌体抗体库技术更成熟、简单和成本低。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种抗p 185OTbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体及其构建方法，为今后抗pl85OTbB2嵌合抗体的基础研究及临床应用奠定了基础。为解决上述技术问题采用如下技术方案抗pl85erbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体，该载体是pWPI/H-IRES-L，其中H和L分别是抗pl85ertB2人鼠嵌合抗体重链基因(SEQ.ID. No. 2)和抗pl85erbB2人鼠嵌合抗体轻链基因(SEQ. ID. No. I)。上述抗P185OTbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体的构建方法，利用PCR法扩增出抗人pl85ertB2鼠源性单抗可变区基因vH和vL以及人IgGl的恒定区基因Y I和K ;再采用三引物PCR法将vH和Yl，vL和K进行拼接，得到嵌合重链H和嵌合轻链L基因，分别插入质粒pVAXl/IRES的IRES元件的上、下游；用内切酶将H-IRES-L从pVAXl/H-IRES-L上切下，插入慢病毒载体pWPI中，即得。上述抗P185ertB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体的构建方法，包括以下步骤<1>鼠抗人P185ertB2单抗轻、重链可变区基因(vL、vH)和人IgGl轻、重链恒定区基因、Yl)的扩增以质粒pSRNC/C K -ZC26为模板，在Taq DNA聚合酶作用下分别用L-A和L-B、Kappa-A和Kappa-B扩增出带信号肽的轻链可变区基因vL和人IgGl轻链恒定区基因k ；以质粒pSRDC/C y 1-ZC26为模板，在Taq DNA聚合酶作用下分别用H-A和H-B、gammal_A和gammal-B扩增出带信号肽的鼠单抗重链可变区基因vH和人IgGl重链恒定区基因、I ;扩增反应条件为94°C预变性5min，94°C变性lmin，56°C退火lmin，72°C延伸lmin 30s，35个循环，72°C延伸IOmin ;用胶回收试剂盒纯化回收PCR产物；<2>嵌合轻链基因L和嵌合重链基因H的拼接按照三引物PCR法，以vL和K为模板，用HiFiTaq DNA聚合酶将两者拼接成嵌合轻链基因L ;以vH和Y I为模板，用HiFiTaq DNA聚合酶将两者拼接成嵌合重链基因H ；第一步在加入模板vL和K或vH和？1，不加引物的情况下，941预变性51^11，941变性lmin, 50°C退火lmin, 72°C延伸lmin, 10个循 环；第二步加入引物L-A和Kappa-B或H-A和gammal-B, 94°C变性 lmin,55°C退火 lmin, 72。。延伸 2m in 15s, 35 个循环,72°C延伸 IOmin ；TP-PCR拼接产物嵌合轻链L或嵌合重链H经过胶回收试剂盒纯化回收后克隆至EZ-T载体，进一步测序验证；<3> 中间质粒 pVAXl/H-IRES-L 的构建用Nsi I和Xba I酶切嵌合轻链L的PCR产物以及质粒PVAX1/IRES，分别经琼脂糖凝胶电泳，纯化回收后，在T4连接酶作用下16°C连接过夜，连接产物转化DH-5a感受态细菌，抽提质粒后经PCR和酶切鉴定，筛选出阳性克隆；进而用BamH I和Pvu I酶切嵌合重链H的PCR产物以及含有嵌合轻链的质粒pVAXl/IRES-L，按上述实验步骤构建并筛选出含嵌合重链的阳性克隆，经基因测序验证，获得共表达嵌合轻、重链的重组质粒PVAXl/H-IRES-L ；<4>慢病毒表达质粒pWPI/H-IRES-L的构建测序正确的pVAXl/H-IRES-L质粒用Pme I单酶切，琼脂糖凝胶分离纯化，用凝胶回收试剂盒回收片段H-IRES-L ;同时，用PmeI酶切慢病毒表达质粒pWPI，经SAP去磷酸化后，用T4DNA连接酶与H-IRES-L连接，连接产物转化DH-5a感受态细菌，抽提质粒后用载体测序引物EFl a和重链下游引物gammal-B作PCR，筛选正向插入阳性克隆pWPI/H-IRES-L，并进行测序验证，即得；上述各引物为H-A :5’ -CGC GGA TCC GCC ACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC T-3’，H-B :5’ -GGG GAA GAC CGA TGG GCC CTT GGT GGA TGA GGA GAC GGT GAC CGAGGT-3，；gamma I-A :5’ -TCC ACC AAG GGC CCA TCG GTC TTC-3，，gammal-B :5，-ATC GAT CGT CAT TTA CCC GGA GAC AGG GAG AG-3，；L-A :5，-TGC ATG CAT GCC ACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC T-3，，L-B :5，-GAT GAA GAC AGA TGG TGC AGC CAC AGT GAT CAC CAC CTT GGT CCCCCC-3，；Kappa-A :5，-ACT GTG GCT GCA CCA TCT GTC TTC-3，，Kappa-B :5，-GGG TCT AGT CTA ACA CTC TCC CCT GTT GAA GCT-3，；EFla :5，-TCA AGC CTC AGA CAG TGG TTC-3，。本专利技术在已经克隆了抗人pl85eAB2鼠单抗的轻、重链可变区基因的基础上，以内部核糖体进入位点(IRES)连接人鼠嵌合轻、重链，构建抗pl85ertB2人鼠嵌合抗体全长基因，并且选择慢病毒载体系统作为嵌合抗体基因转移的工具，本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李力，刘芳，张玮，
申请(专利权)人：广西壮族自治区肿瘤防治研究所，
类型：发明
国别省市：
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