包含纯化的重组多肽的方法和组合物技术

本发明专利技术提供了从中国仓鼠卵巢宿主细胞分离的纯化的重组多肽，包括抗体(如治疗抗体)，以及该多肽的制备方法和使用方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉参考本申请要求2013年9月13日提交的美国临时申请号61/877,517的优先权的权益，在此通过引用以其整体并入。序列表本申请包含已通过EFS-Web提交的序列表，并且在此通过引用以其整体并入。所述ASCII副本创建于2014年8月28日，被命名为2014.AUG.28P5704R1-WOSequenceListing.txt，大小34,811字节。
提供了从中国仓鼠卵巢宿主细胞分离的纯化的重组多肽(包括抗体，如治疗性抗体)以及制备和使用此类多肽的方法。
技术介绍
许多药物用于治疗哮喘和其他呼吸疾患已经上市或正在开发中。用于哮喘治疗的一个靶标是IL-13。IL-13是由激活的T细胞、NKT细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和肥大细胞产生的多效性TH2细胞因子，在临床前模型中已强烈暗示其参与哮喘的发病机理。以前已描述了IL-13拮抗剂，包括抗IL-13抗体。某些此类抗体也已经被开发用于人治疗。最近，一些研究表明针对IL-13的单克隆抗体在治疗哮喘中的临床活性(例如，见Corren等人,2011,N.Engl.J.Med.365,1088-1098；Gauvreau等人,2011,Am.J.Respir.Crit.CareMed.183,1007-1014；IngramandKraft,2012,J.AllergyClin.Immunol.130,829-42；Webb,2011,NatBiotechnol29,860-863)。在这些单克隆抗体中，lebrikizumab，一种中和IL-13活性的人源化IgG4抗体，改善了对大多数尽管用吸入糖皮质激素和长效β2-肾上腺素受体激动剂治疗了但仍然有症状的哮喘患者的肺功能(Corren等人,2011,N.Engl.J.Med.365,1088-1098)。此外，已暗示IL-13参与许多其他过敏性和纤维化疾患。例如，由IL13介导的这类疾病和/或病症(condition)包括但不限于，过敏性哮喘、非过敏性(内源性)哮喘、过敏性鼻炎、过敏性皮炎、过敏性结膜炎、湿疹、荨麻疹、食物过敏、慢性阻塞性肺病、溃疡性结肠炎、RSV感染、葡萄膜炎、硬皮病和骨质疏松。为了使重组生物制药蛋白被接受用于人患者施用，重要的是从最终生物产物中除去制造和纯化方法中产生的残余杂质。这些方法组分包括培养基蛋白、免疫球蛋白亲和配体、病毒、内毒素、DNA和宿主细胞蛋白。这些宿主细胞杂质包括方法特定的宿主细胞蛋白(HCP)，其是来自重组DNA技术的生物制剂中的方法相关杂质/污染物。尽管HCP通常少量(以每百万预期重组蛋白中的若干份或每毫克预期重组蛋白中的纳克)存在于最终药品(drugsubstance)中，公认HCP是不所期望的的、其数量应减到最小。例如，美国食品和药物管理局(FDA)要求用于人体内的生物制药应该尽可能地不含外来杂质，并且要求检测和定量潜在污染物/杂质(如HCP)的测试。从细胞碎片纯化蛋白的步骤首先取决于蛋白质表达的位点。一些蛋白质直接从细胞分泌到周围的生长培养基；另一些蛋白质在细胞内生成。对于后者，纯化方法的第一步包括细胞裂解，这可以通过多种方法进行，包括机械剪切、渗透压休克、或酶处理。这种破坏使细胞的全部内容物释放到匀浆中，并且另外产生由于其尺寸小而难以除去的亚细胞碎片。这些通常通过离心或过滤除去。直接分泌的蛋白质也出现同样的问题，原因是细胞的自然死亡和蛋白质生产方法运行中细胞内宿主细胞蛋白质的释放。一旦获得含有目的蛋白质的溶液，通常使用不同色谱法技术的组合试图从细胞产生的其他蛋白质中分离该目的蛋白质。通常情况下，这些技术基于蛋白质的电荷、疏水性程度或大小分离蛋白质混合物。对于这些技术中的每种可采用几种不同的色谱法树脂，该色谱法树脂允许为所包含的特定蛋白质精确定制纯化方案。这些分离方法中每个的本质是，或者可以使蛋白质以不同的速率沿着柱向下移动、当其进一步向下通过柱时，实现物理分离的增加；或者使蛋白质选择性地粘附到分离介质，然后通过不同溶剂差异洗脱。在一些情况下，当杂质特异地粘附至柱、而感性趣的蛋白质并不特异地粘附至柱时，所期望的蛋白质从杂质分离，即，目的蛋白质存在于“流出液(flow-through)”。离子交换色谱法，针对可交换的抗衡离子(counterion)命名，是适用于可电离分子的纯化方法。电离分子基于其带电基团与附着至固相支持基质的相反电荷的分子的非特异性静电相互作用被分离，由此阻滞那些与固相更强地相互作用的电离分子。每类电离分子的净电荷和其对基质的亲和力，根据带电基团的数量、各基团的电荷、与带电固相基质竞争相互作用的分子的性质而变化。这些差异导致离子交换色谱法对不同类型分子的分离。在使用离子交换色谱法典型的蛋白质纯化中，如在哺乳动物细胞培养物中的来自宿主细胞的许多蛋白质的混合物，被施加到离子交换柱。非结合分子被洗掉后，例如通过以逐步或梯度模式改变pH值、抗衡离子浓度等调节条件，从固相释放目的非特异性保留或阻滞的电离蛋白质，并将其从具有不同带电特性的蛋白质中分离出来。阴离子交换色谱法涉及目的阴离子分子在特定分离方法的pH和条件下与负性抗衡离子竞争与附着至固相基质上的带正电荷的分子的相互作用。与此相反，阳离子交换色谱法涉及目的阳离子分子在特定分离方法的pH和条件下与正性抗衡离子竞争与附着至固相基质上的带负电荷的分子的相互作用。混合模式离子交换色谱法(也称为多模式离子交换色谱法)涉及在相同的步骤中使用阳离子和阴离子交换色谱法介质的组合。特别是，“混合模式”指的是共价附着阳离子交换、阴离子交换、以及疏水相互作用部分的混合物的固相支持基质。蛋白质的羟磷灰石色谱法涉及蛋白质的带电氨基或羧基与羟磷灰石上带相反电荷基团的非特异性相互作用，其中羟磷灰石和蛋白质的净电荷被缓冲液pH值控制。通过用离子如Ca2+或Mg2+置换非特异性蛋白质-羟磷灰石对完成洗脱。带负电的蛋白质基团由带负电的化合物(如磷酸盐)置换，从而洗脱净负电荷的蛋白质。疏水相互作用色谱法(HIC)通常根据其表面疏水性的差异用于纯化和分离分子，如蛋白质。蛋白质的疏水基团与耦合到色谱法基质的疏水基团非特异性地相互作用。蛋白质表面疏水基团的数量和性质的差异导致蛋白质在HIC柱上差异阻滞，从而分离蛋白质混合物中的蛋白质。亲和色谱法，利用了待纯化蛋白质和固定的捕获剂之间特异的结构上依赖(即，空间互补)的相互作用，其是一些蛋白质(例如抗体)的标准纯化选择。例如蛋白A是蛋白质(如抗体，其包含Fc区)亲和色谱法的有用的吸附剂。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种包含从中国仓鼠卵巢宿主细胞纯化的抗IL‑13单克隆抗体的组合物，其中所述组合物包含抗IL‑13抗体和残留量的仓鼠PLBL2，其中仓鼠PLBL2的量小于20ng/mg，或小于15ng/mg，或小于10ng/mg，或小于8ng/mg，或小于5ng/mg，或小于3ng/mg，或小于2ng/mg，或小于1ng/mg，或小于0.5ng/mg。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.09.13 US 61/877,5171.一种包含从中国仓鼠卵巢宿主细胞纯化的抗IL-13单克隆抗体的组合物，其中所述
组合物包含抗IL-13抗体和残留量的仓鼠PLBL2，其中仓鼠PLBL2的量小于20ng/mg，或小于
15ng/mg，或小于10ng/mg，或小于8ng/mg，或小于5ng/mg，或小于3ng/mg，或小于2ng/mg，或
小于1ng/mg，或小于0.5ng/mg。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中抗IL-13抗体包含三个重链CDR和三个轻链CDR，
所述三个重链CDR是具有氨基酸序列SEQIDNO：1的CDR-H1、具有氨基酸序列SEQIDNO：2
的CDR-H2和具有氨基酸序列SEQIDNO：3的CDR-H3，所述三个轻链CDR是具有氨基酸序列
SEQIDNO：4的CDR-L1、具有氨基酸序列SEQIDNO：5的CDR-L2和具有氨基酸序列SEQID
NO：6的CDR-L3。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中抗IL-13抗体包含具有氨基酸序列SEQIDNO：7
的重链可变区。
4.根据权利要求2所述的组合物，其中抗IL-13抗体包含具有氨基酸序列SEQIDNO：9
的轻链可变区。
5.根据权利要求3所述的组合物，其中抗IL-13抗体包含具有氨基酸序列SEQIDNO：10
的重链。
6.根据权利要求4所述的组合物，其中抗IL-13抗体包含具有氨基酸序列SEQIDNO：14
的轻链。
7.根据权利要求2所述的组合物，其中抗IL-13抗体包含具有氨基酸序列SEQIDNO：7
的重链可变区和具有氨基酸序列SEQIDNO：9的轻链可变区。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中抗IL-13抗体包含具有氨基酸序列SEQIDNO：10
的重链和具有氨基酸序列SEQIDNO：14的轻链。
9.根据权利要求1所述的组合物，其中使用免疫测定法或质谱测定法定量仓鼠PLBL2的
量。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中免疫测定法是总中国仓鼠卵巢蛋白ELISA或仓
鼠PLBL2ELISA。
11.根据权利要求9所述的组合物，其中质谱测定法是LC-MS/MS。
12.一种从中国仓鼠卵巢宿主细胞分离的经纯化的抗IL-13单克隆抗体制剂，其中所述
制剂通过包括疏水相互作用色谱法(HIC)步骤的方法纯化，从而生成纯化的制剂，其中纯化
的制剂包含抗IL-13抗体和残留量的仓鼠PLBL2，其中仓鼠PLBL2的量小于20ng/mg，或小于
15ng/mg，或小于10ng/mg，或小于8ng/mg，或小于5ng/mg，或小于3ng/mg，或小于2ng/mg，或
小于1ng/mg，或小于0.5ng/mg。
13.根据权利要求12所述的抗IL-13抗体制剂，其中HIC步骤包括PHENYLSEPHAROSETM6FastFlow(HighSub)树脂。
14.根据权利要求13所述的抗IL-13抗体制剂，其中HIC步骤包括在流出模式操作含
PHENYLSEPHAROSETM6FastFlow(HighSub)树脂的柱。
15.根据权利要求14所述的抗IL-13抗体制剂，其中HIC步骤包括平衡缓冲液和洗涤缓
冲液，其中平衡缓冲液和洗涤缓冲液各包含50mM乙酸钠pH5.0。
16.根据权利要求15所述的抗IL-13抗体制剂，其中在280纳米的吸光度监测流出液和
收集0.5OD至1.5OD之间的流出液。
17.根据权利要求15所述的抗IL-13抗体制剂，其中收集最多8个柱体积的流出液。
18.根据权利要求12所述的抗IL-13抗体制剂，其中方法进一步包括亲和色谱法步骤。
19.根据权利要求18所述的抗IL-13抗体制剂，其中亲和色谱法是蛋白A色谱法。
20.根据权利要求12所述的抗IL-13抗体制剂，其中方法进一步包括离子交换色谱法步
骤。
21.根据权利要求20所述的抗IL-13抗体制剂，其中离子交换色谱法为阴离子交换色谱
法。
22.一种从中国仓鼠卵巢细胞分离的经纯化的抗IL-13单克隆抗体制剂，其中所述抗体
制剂通过包括第一蛋白A亲和色谱法步骤、第二阴离子交换色谱法步骤、和第三疏水相互作
用色谱法(HIC)步骤的方法纯化，从而产生纯化的制剂，其中纯化的制剂包含抗IL-13抗体
和残留量的仓鼠PLBL2，其中仓鼠PLBL2的量小于20ng/mg，或小于15ng/mg，或小于10ng/mg，
或小于8ng/mg，或小于5ng/mg，或小于3ng/mg，或小于2ng/mg，或小于1ng/mg，或小于0.5ng/
mg。
23.根据权利要求22所述的抗IL-13抗体制剂，其中亲和色谱法步骤包括MABSELECT
SURETM树脂，阴离子交换色谱法步骤包括QSEPHAROSETMFastFlow树脂，和HIC步骤包括
PHENYLSEPHAROSETM6FastFlow(HighSub)树脂。
24.根据权利要求23所述的抗IL-13抗体制剂，其中
亲和色谱法步骤包括在结合-洗脱模式操作含MABSELECTSURETM树脂的柱；
阴离子交换色谱法步骤包括在结合-洗脱模式操作含QSEPHAROSETMFastFlow树脂的
柱；
HIC步骤包括在流出模式操作含PHENYLSEPHAROSETM6FastFlow(HighSub)树脂的
柱。
25.根据权利要求12或权利要求22所述的抗IL-13抗体制剂，其中抗IL-13抗体包含三
个重链CDR和三个轻链CDR，其中所述三个重链CDR的具有氨基酸序列SEQIDNO：1的CDR-
H1、具有氨基酸序列SEQIDNO：2的CDR-H2和具有氨基酸序列SEQIDNO：3的CDR-H3，所述
三个轻链CDR是具有氨基酸序列SEQIDNO：4的CDR-L1、具有氨基酸序列SEQIDNO：5的
CDR-L2和具有氨基酸序列SEQIDNO：6的CDR-L3。
26.根据权利要求25所述的抗IL-13抗体制剂，其中抗IL-13抗体包含具有氨基酸序列
SEQIDNO：7的重链可变区。
27.根据权利要求25所述的抗IL-13抗体制剂，其中抗IL-13抗体包含具有氨基酸序列
SEQIDNO：9的轻链可变区。
28.根据权利要求26所述的抗IL-13抗体制剂，其中抗IL-13抗体包含具有氨基酸序列
SEQIDNO：10的重链。
29.根据权利要求27所述的抗IL-13抗体制剂，其中抗IL-13抗体包含具有氨基酸序列
SEQIDNO：14的轻链。
30.根据权利要求25所述的抗IL-13抗体制剂，其中抗IL-13抗体包含具有氨基酸序列
SEQIDNO：7的重链可变区和具有氨基酸序列SEQIDNO：9的轻链可变区。
31.根据权利要求30所述的抗IL-13抗体制剂，其中抗IL-13抗体包含具有氨基酸序列
SEQIDNO：10的重链和具有氨基酸序列SEQIDNO：14的轻链。
32.根据权利要求12或权利要求22所述的抗IL-13抗体制剂，其中使用免疫测定法或质
谱测定法定量仓鼠PLBL2的量。
33.根据权利要求32所述的抗IL-13抗体制剂，其中免疫测定法是总中国仓鼠卵巢蛋白
ELISA或仓鼠PLBL2ELISA。
34.根据权利要求32所述的抗IL-13抗体制剂，其中质谱测定法是LC-MS/MS。
35.一种纯化中国仓鼠卵巢宿主细胞中生产的重组多肽的方法，其中所述方法提供了
包含重组多肽和残留量仓鼠PLBL2的纯化制剂。
36.根据权利要求35所述的方法，其中仓鼠PLBL2的量小于20ng/mg，或小于15ng/mg，或
小于10ng/mg，或小于8ng/mg，或小于5ng/mg，或小于3ng/mg，或小于2ng/mg，或小于1ng/mg，
或小于0.5ng/mg。
37.根据权利要求36所述的方法，其包括疏水相互作用色谱法(HIC)步骤。
38.根据权利要求37所述的方法，其中HIC步骤包括PHENYLSEPHAROSETM6FastFlow
(HighSub)树脂。
39.根据权利要求38所述的方法，其中HIC步骤包括在流出模式操作含PHENYL
SEPHAROSETM6FastFlow(HighSub)树脂的柱。
40.根据权利要求37所述的方法，其中重组多肽选自生长因子、细胞因子、抗体、抗体片
段和免疫粘附素。
41.根据权利要求40所述的方法，其中重组多肽是抗体。
42.根据权利要求41所述的方法，其中抗体是人源化单克隆抗体。
43.根据权利要求42所述的方法，其中抗体是IgG1、或IgG2或IgG3或IgG4。
44.根据权利要求43所述的方法，其中抗体是IgG4。
45.根据权利要求41所述的方法，其中抗体是抗IL-13。
46.根据权利要求44所述的方法，其中抗体是lebrikizumab。
47.根据权利要求45所述的方法，其中抗IL-13抗体包含三个重链CDR和三个轻链CDR，
所述三个重链CDR是具有氨基酸序列SEQIDNO：1的CDR-H1、具有氨基酸序列SEQIDNO：2
的CDR-H2和具有氨基酸序列SEQIDNO：3的CDR-H3，所述三个轻链CDR是具有氨基酸序列
SEQIDNO：4的CDR-L1、具有氨基酸序列SEQIDNO：5的CDR-L2和具有氨基酸序列SEQID
NO：6的CDR-L3。
48.根据权利要求45、46或47任一项所述的方法，其中HIC步骤包括在流出模式操作含
树脂柱，包括平衡缓冲液和洗涤缓冲液，其中平衡缓冲液和洗涤缓冲液各包含50mM乙酸钠
pH5.0。
49.根据权利要求48所述的方法，其中在280纳米的吸光度监测流出液和收集0.5OD至
1.5OD之间的流出液。
50.根据权利要求48所述的方法，其中收集最多8个柱体积的流出液。
51.根据权利要求48所述的方法，进一步包括亲和色谱法步骤。
52.根据权利要求5...

【专利技术属性】
技术研发人员：X·C·于，S·K·费舍尔，S·C·菲舍尔，J·洛，A·纳伊姆，A·M·桑切斯，C·A·特斯克，M·范德兰，A·阿姆劳，J·富兰克林，C·维克塔，
申请(专利权)人：豪夫迈·罗氏有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH