制备生理活性多肽复合物的改进方法技术

本发明专利技术公开的是一种制备复合物的方法，该复合物中的生理活性多肽通过非肽基连接体共价结合至免疫球蛋白恒定区。该方法的特征在于还原剂的使用，由此可以克服传统的低产率和多肽修饰的问题。可以以高纯度和高产率以及低成本生产生理活性多肽‑非肽基聚合物‑免疫球蛋白恒定区复合物。因此，该方法在工业上是有用的。而且，通过表现出长效特征，该生理活性多肽‑非肽基聚合物‑免疫球蛋白恒定区复合物可以有效地用于开发具有改善的药物顺应性的生理活性多肽的长效制剂。

【技术实现步骤摘要】
制备生理活性多肽复合物的改进方法本申请是分案申请，原申请的申请日为2013年3月8日，申请号为201380023673.2，专利技术名称为“制备生理活性多肽复合物的改进方法”。
本专利技术涉及制备复合物的方法，该复合物中的生理活性多肽通过含两个或更多个醛作为官能团的非肽基聚合物连接体共价结合至免疫球蛋白恒定区。更具体地，本专利技术涉及有效制备生理活性多肽复合物的方法，其特征在于通过在制备时调整还原剂的使用来改进低产率和多肽试剂变形的问题。
技术介绍
总体而言，生理活性多肽由于它们的低稳定性而容易变性，并且在血液中容易经历蛋白水解降解和随后的肾或肝脏清除。因此，含生理活性多肽作为药物成分的蛋白质药物需要频繁地对患者给药，以维持适当的血清水平和效价。然而，此类蛋白质药物的频繁给药(其大多数是以注射的形式)引起患者疼痛而且治疗成本高。为了解决这些问题，已经投入许多努力来改进蛋白质药物的血清稳定性，和使血液中的药物长期维持在高水平以使药物的药效达到最大。作为长效制剂使用的需求，蛋白质药物必须配制成具有高稳定性并且维持足够高水平的效价而不引发患者的免疫应答。传统的稳定蛋白质和防止酶降解及肾脏清除的方法是用具有高溶解度的聚合物(例如，聚乙二醇(在下文中称为“PEG”)对蛋白质药物的表面进行化学修饰。通过结合至目标蛋白的特定区域或各种区域，PEG使得蛋白质的溶解度更高，从而稳定蛋白质并防止水解而不引起严重的副作用(Sada等人，J.发酵生物工程(J.FermentationBioengineering)71:137-139)。例如，WO2006/076471公开了通过将B-型钠尿肽(BNP)与PEGs结合而使其长效的方法，该PEGs结合至钠尿肽受体A(NPR-A)以引发cGMP的合成，从而降低动脉血压。其因而用于充血性心力衰竭的治疗。美国专利号6,924,264描述了一种通过使其赖氨酸残基PEG化来改进艾塞那肽(exendin-4)在体内的持续时间的方法。然而，在此方法中，尽管其有能力通过增加PEG的分子量来增加肽药物的循环时间，但PEG化仍有问题，例如，大大降低了肽药物的效价和降低了产率，这是因为随着PEG的分子量增加，肽的反应性下降。WO02/46227公开了这样的融合蛋白，其中GLP-1和艾塞那肽(exendin-4)或其类似物与人血清白蛋白或通过遗传重组制备的免疫球蛋白片段(Fc)结合。美国专利号6,756,480涉及这样的融合蛋白，其中甲状旁腺激素(PTH)或其类似物连接至Fc。虽然这些方法可被评估为PEG化问题——例如低产率和非特异性——的解决方案，但是已经显示其增加目标肽的体内半衰期的效果不显著，与预期相反，而且在某些情况下，融合蛋白具有低效价。虽然多种肽基连接体被利用以使增加血清半衰期的效果达到最大，但它们有可能引起免疫应答。此外，具有二硫键的肽(例如，BNP)在实际应用中有困难，因为其很容易引起错误折叠。此外，不可能通过遗传重组产生具有非天然氨基酸残基的肽基连接体。胰岛素是由人胰腺β-细胞分泌的肽，主要是调节体内血糖水平。当胰岛素分泌不正常或分泌的胰岛素无法在体内适当地发挥作用时，血糖水平不能被控制并且升高，导致糖尿病。后一种情况称为2型糖尿病。然而，在胰岛素不能从胰腺分泌并且引起血糖水平升高的情况下，导致1型糖尿病。2型糖尿病患者用口服降血糖剂治疗，其中一些患者用胰岛素治疗。同时，对于1型糖尿病患者基本上需要注射胰岛素。通常，通过在每餐之前或之后每天注射三次来施用胰岛素进行胰岛素疗法。然而，每天三次连续胰岛素给药对于患者是痛苦的而且不方便。已经做出很多尝试来解决这些问题。旨在提高蛋白质药物在生物膜中的通透性的一种策略是通过口或鼻吸入来递送药物。然而，与注射相比，通过口或鼻吸入给药的递送效率明显地低，并且难以将肽药物维持在体内活性所需的水平。作为可供选择的策略，可以将过量药物皮下注射并以延迟的方式吸收至体内，以维持恒定的血液水平，即使每天注射一次。一些药物(例如，兰德仕(Lantus))、赛诺菲安万特(Sanofi-aventis))已被批准用于商业用途并且目前已对患者给药。另外，已经针对用脂肪酸修饰胰岛素进行了研究以使胰岛素结合物的结合更强并通过在注射位置或血液中与白蛋白组合来延长持续时间。一些药物(例如，诺和平(Levemir)、诺和诺德(NovoNordisk))已被批准用于商业用途。然而，这些药物在注射位置引起疼痛并且必须每天注射一次，这对患者仍是巨大的负担。为了克服现有技术中遇到的问题，本专利技术者已制备了含生理活性多肽和免疫球蛋白恒定区(其通过使用非肽基聚合物作为连接体连接)的复合物，作为同时增加生理活性多肽(如，胰岛素)的血浆半衰期和体内持续时间的策略。然而，还需要以高产率和高纯度制备复合物的方法，因为该复合物的成分非常昂贵。出于此考虑，本专利技术者已经开发了以降低的成本、高产率和高纯度制备生理活性多肽复合物的方法，该方法在复合物生产的反应期间，在反应溶液中使用最佳浓度的合适种类的还原剂，从而完成本专利技术。
技术实现思路
技术问题本专利技术的目的是提供制备复合物的有效方法，其中生理活性多肽通过含两个或更多个醛作为官能团的非肽基聚合物连接体共价结合至免疫球蛋白恒定区，其特征在于在反应期间，通过在反应溶液中使用最佳浓度的合适种类的还原剂来改进低产率和多肽试剂变形的问题。问题解决方案一方面，为了实现上述目的，本专利技术提供制备生理活性多肽-非肽基聚合物-免疫球蛋白恒定区的复合物的方法，其包括(1)在浓度为1-20mM的还原剂的存在下，使具有两个或更多个醛作为官能团的非肽基聚合物与生理活性多肽或免疫球蛋白恒定区的其中之一反应；和(2)使(1)的反应混合物与生理活性多肽或免疫球蛋白恒定区中的另一个在浓度为1-100mM的还原剂的存在下反应。该反应混合物可包括非肽基聚合物与生理活性多肽的结合物或非肽基聚合物与免疫球蛋白恒定区的结合物，和/或保持未反应的反应物。因此，本专利技术的方法可进一步包括：在步骤(1)之后，从反应混合物中分离生理活性多肽-非肽基聚合物的结合物或免疫球蛋白-非肽基聚合物的结合物。本文所用的术语“非肽基聚合物”是指由至少两个重复单元组成的生物相容性聚合物，该重复单元通过除肽键外的任意共价键保持在一起。用于本专利技术的非肽基聚合物的例子包括：聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇与丙二醇的共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯基醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚、生物可降解聚合物(例如，聚乳酸(PLA)和聚乳酸-羟基乙酸(PLGA))、脂质聚合物、壳多糖、玻尿酸及其组合，优选聚乙二醇(PEG)。本领域中众所周知的其衍生物和容易使用本领域已知的方法制备的衍生物均在本专利技术的范围内。如上所述，非肽基聚合物可具有两个或更多个醛作为官能团。因此，上面所列出的非肽基聚合物本身可以是双-或-多功能醛形式或优选地在其两个或更多个醇基上包含具有醛基的取代基。具有醛基的取代基可以是烷基醛(例如，丙醛或丁醛)。在一个优选实施例中，非肽基聚合物可以是在其每个末端上具有丙醛取代基的PEG。通过框内融合技术构建的融合蛋白质中所使用的传统肽基连接体的缺点是肽基连接体容易在体内被蛋白酶裂解，因而不能通过载体确保血清半衰期的延长，这与预期相反。然而，在本专利技术中，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.制备生理活性多肽‑非肽基聚合物‑免疫球蛋白恒定区复合物的方法，其包括：(1)使具有两个或更多个醛作为官能团的非肽基聚合物与生理活性多肽或免疫球蛋白恒定区的其中之一在浓度为1mM至小于20mM的还原剂的存在下反应；和(2)使步骤(1)的反应混合物与生理活性多肽或免疫球蛋白恒定区中的另一个在浓度为1‑100mM的还原剂的存在下反应。

【技术特征摘要】
2012.03.08 KR 10-2012-00241361.制备生理活性多肽-非肽基聚合物-免疫球蛋白恒定区复合物的方法，其包括：(1)使具有两个或更多个醛作为官能团的非肽基聚合物与生理活性多肽或免疫球蛋白恒定区的其中之一在浓度为1mM至小于20mM的还原剂的存在下反应；和(2)使步骤(1)的反应混合物与生理活性多肽或免疫球蛋白恒定区中的另一个在浓度为1-100mM的还原剂的存在下反应。2.权利要求1所述的方法，进一步包括：在步骤(1)之后，从所述反应混合物中分离出生理活性多肽-非肽基聚合物的结合物或免疫球蛋白恒定区-非肽基聚合物的结合物。3.权利要求1所述的方法，其中所述还原剂的作用是还原在所述非肽基聚合物的所述醛基与所述生理活性多肽或所述免疫球蛋白恒定区的胺基之间结合所产生的可逆性亚胺双键以形成共价键。4.权利要求1所述的方法，其中步骤(2)中使用的所述还原剂选自氰基硼氢化钠、硼烷吡啶复合物、硼氢化钠、硼烷二甲基胺复合物、硼烷三甲基胺复合物和三乙酰氧基硼氢化钠。5.权利要求1所述的方法，其中在步骤(2)中，所述还原剂的使用浓度为1至40mM。6.权利要求1所述的方法，其中步骤(1)中的所述反应进行1至16小时。7.权利要求1所述的方法，其中步骤(2)中的所述反应进行1至48小时。8.权利要求1所述的方法，其中骤(1)中的所述反应在0至25℃的温度下进行。9.权利要求1所述的方法，其中步骤(1)中的所述反应在0至25℃下，在浓度为1mM至小于20mM的所述还原剂的存在下进行1至16小时，并且步骤(2)中的所述反应在浓度为1至40mM的所述还原剂的存在下进行1至48小时。10.权利要求1所述的方法，其中所述非肽基聚合物通过其两个或更多个醛官能团共价连接至所述生理活性多肽和所述免疫球蛋白恒定区的每一个。11.权利要求1所述的方法，其中所述非肽基聚合物的所述官能团连接至所述生理活性多肽和所述免疫球蛋白恒定区的各自的胺基，其中所述胺基存在于N-末端或Lys残基的侧链上。12.权利要求1所述的方法，其中所述非肽基聚合物选自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙基醚、聚乳酸(PLA)、聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)、脂质聚合物、壳多糖、玻尿酸、和其组合。13.权利要求1所述的方法，其中所述非肽基聚合物是聚乙二醇。14.权利要求1所述的方法，其中所述非肽基聚合物的分子量范围是从1至100kDa。15.权利要求1所述的方法，其中所述免疫球蛋白恒定区是无糖基化的。16.权利要求1所述的方法，其中所述免疫球蛋白恒定区由一个至四个结构域组成，所述一个至四个结构域选自CH1、CH2...

【专利技术属性】
技术研发人员：张明贤，金玟永，李钟守，金大振，裴城敏，权世昌，
申请(专利权)人：韩美科学株式会社，
类型：发明
国别省市：韩国,KR