高密度培养大肠杆菌细胞的方法技术

本发明专利技术公开一种高密度培养大肠杆菌细胞的方法，其包含细胞生长步骤和表达诱导步骤，通过所述步骤可以获得细胞质量的最大值以及伴随的重组蛋白的最大表达。可以使用本发明专利技术的培养方法使经转型以产生相关重组蛋白的大肠杆菌以高浓度生长。因此，所述方法增加了细胞的生产率以及所述重组蛋白的生产量，并且可以广泛应用于有效生产重组蛋白。

Method of high-density culture of Escherichia coli cells

The invention discloses a method for culturing E. coli cells with high density, which comprises a cell growth step and an expression induction step through which the maximum cell mass and the accompanying maximum expression of recombinant proteins can be obtained. The culture method of the present invention can be used to make E. coli, which is transformed to produce related recombinant proteins, grow at high concentrations. Therefore, the method increases the cell productivity and the production of the recombinant protein, and can be widely used for the effective production of the recombinant protein.

【技术实现步骤摘要】
高密度培养大肠杆菌细胞的方法本申请是分案申请，原申请的申请日为2013年3月12日，中国申请号为201380013931.9，国际申请号为PCT/KR2013/001980，专利技术名称为“高密度培养大肠杆菌细胞的方法”。
本专利技术涉及一种高密度培养大肠杆菌细胞的方法。更确切地说，本专利技术涉及一种培养大肠杆菌细胞以使其增殖增到最大的方法，其包含使大肠杆菌细胞生长和诱导重组蛋白表达以使细胞质量和重组蛋白的量增到最大的步骤。
技术介绍
大肠杆菌由于其可用于大肠杆菌的培养和基因工程的高生长速率和发酵学和基因工程领域中的先进技术而成为大批量生产各种有用蛋白质最常使用的宿主细胞。高产量生产重组蛋白需要以高密度培养转型的大肠杆菌细胞。为此目的，已开发不同类型的培养基，如复合培养基、合成培养基和半合成培养基，以及各种进给培养基的方法，如恒定速率进给、逐步增加进给速率、指数进给或特定生长速率控制、恒酸度(pH-stat)和恒溶氧(DO-stat)控制以及葡萄糖和乙酸浓度控制且用于获得高细胞密度的大肠杆菌。但实际上，培养转型菌株中的每一种均有特定方法和最佳条件。因此，对于高产量蛋白质生产，重要的是选择进给培养基和培养细胞的最佳方法。一般来说，在通过重组大肠杆菌生产重组蛋白中，对应启动子和表达蛋白的特征影响细胞的每一单元的细胞生长速率和生产率。对于蛋白质表达通过强启动子控制的系统，重组蛋白的快速表达可以打破宿主细胞的能量代谢平衡，进而抑制细胞生长。尤其当表达蛋白对宿主细胞具有直接负面影响时，其在较大程度上抑制宿主细胞的生长。由于这些原因，强诱导型启动子下的蛋白质表达变为宿主细胞的重大负担。因此，当此负担降到最小时，可以更容易地实现重组蛋白的大批量生产。考虑以上条件，最佳表达时间可以视表达蛋白的特征而变化，即使在使用相同类型的表达载体和宿主细胞进行蛋白质表达时也是如此。另外，表达时间对细胞生长和表达速率的影响的显著性可以有所变化。此外，细胞生长速率和细胞质量影响蛋白质生产。在每细胞生产率相同的情况下，使用较高质量的细胞可以增加蛋白质生产的产量。因此，重要的是在通过重组微生物生产重组蛋白中建立以高密度生产细胞团块的最佳培养条件。由于转型大肠杆菌的蛋白质表达与关于生长环境的各种胞内生理/生态因子(质粒复制品的稳定性和数目、转录和转译效率、表达蛋白的溶解度、蛋白分解、膜完整性等)密切相关，所以建立最佳培养条件以使生产量和生产率增到最大为至关重要的。因此，为了以高产量表达重组蛋白，需要添加适当诱导物，如IPTG，并且需要通过适当方法将具有适用于蛋白质生产的组合物的培养基进给到高密度重组大肠杆菌的培养基中。必要时，必须改进培养基组合物和进给其的方法以用于重组蛋白生产(易(Yee)和布兰奇(Blanch),1992,生物技术(Bio/Technol.)10,1550-1556)。在大肠杆菌中表达重组蛋白的方法可以分成三种代表性类型。第一种方法为将重组蛋白表达为大肠杆菌细胞的细胞质中的可溶形式。第二种方法为使用信号序列将重组蛋白表达到大肠杆菌细胞的胞外质。另一种方法为以包涵体(IB)形式表达蛋白质，且此方法最常用于在高产量下表达蛋白质。当以IB形式表达蛋白质时，需要以高密度培养大肠杆菌细胞。详细地说，在每一细胞具有类似蛋白质表达的情况下，当大肠杆菌细胞在较高密度下生长时，可以获得较高产量的蛋白质产物。因此，已存在许多关于研究以高密度生长大肠杆菌细胞的方法的研究。韩国专利第10-0235315号公开一种融合蛋白质用于过度表达人类生长激素的用途，但发现细胞质量为约90到100克/升。此外，观察到两步发酵条件下的重组蛋白生产过程中，最终吸光度(OD600)不高于150(微生物细胞工厂(MicrobCellFact.)2008年8月7日；7:26)。同样，生产像萨莫辛(salmosin)的蛋白质的高密度培养条件每升仅产生65.70gIB(微生物学与生物技术期刊(JMicrobiolBiotechnol.)2011年10月21日；(10):1053-6)。另外，生产IFNγ的培养条件每升细胞培养物仅产生约100g细胞团块(工业微生物学与生物技术杂志(JIndMicrobiolBiotechnol.)2004年2月；31(2):63-9.电子版2004年2月19日)。因此，对于开发一种以较高密度培养大肠杆菌细胞的方法仍有很高需求。基于此背景，在努力开发一种以高产量生产重组蛋白的方法的过程中，本专利技术人已发现当在培养转型大肠杆菌细胞的步骤与诱导重组蛋白的表达的步骤之间用不同类型的培养基培养宿主细胞时，可以实现转型大肠杆菌中重组蛋白的大批量生产，进而完成本专利技术。
技术实现思路
技术难题因此，本专利技术的一个目标为提供一种高密度培养大肠杆菌细胞的方法。技术解决方案作为实现本专利技术的目标的一个实施例，本专利技术提供一种高浓度培养大肠杆菌细胞的方法。具体来说，本专利技术提供一种培养大肠杆菌细胞的方法，其包含(i)在细胞生长培养基中以分批培养模式培养大肠杆菌细胞直到培养基的pH增加0.1或大于0.1；(ii)在细胞培养基的pH增加时通过添加第一进料培养基以分批进料培养模式培养大肠杆菌细胞；以及(iii)在细胞培养物中600nm下的吸光度(OD600)增加150或大于150时通过添加第二进料培养基以分批进料培养模式培养大肠杆菌细胞。为了本专利技术的目标，大肠杆菌可以是表现重组蛋白的转型大肠杆菌。如本文所用，术语“细胞生长培养基”是指用于生长大肠杆菌细胞的培养基。出于本专利技术的目的，细胞生长培养基可以包含为大肠杆菌提供生长环境的初始培养基，和控制pH并促进大肠杆菌生长的痕量金属溶液，但不限于此。初始培养基的类型不限，但优选地含有胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl、KH2PO4和(NH4)2HPO4。并且痕量金属溶液不限，但其优选地含有柠檬酸、FeCl2、H3BO3、MnCl2、CuCl2、Na2MoO4、CoCl2、ZnCl2和EDTA。此外，细胞生长培养基可以优选地由20g/l胰蛋白胨、10g/l酵母提取物、10g/lNaCl、207.5g/lKH2PO4、50g/l(NH4)2HPO4、268g/l柠檬酸、270g/lFeCl2、30g/lH3BO3、100g/lMnCl2、15g/lCuCl2、25g/lNa2MoO4、25g/lCoCl2、20g/lZnCl2和0.5MEDTA组成。任选地，细胞生长培养基可以包含所属领域的技术人员选择的额外组分。本专利技术的方法可以进一步包含在进行步骤(iii)期间或之后诱导重组蛋白的表达。优选地，可以与进行步骤(iii)同时诱导大肠杆菌以表达重组蛋白。更优选地，可以将用于蛋白质表达的诱导物添加到第二进料培养基中。此外，可以通过添加异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)诱导重组蛋白的表达。更优选地，添加的IPTG的浓度可以为0.1到0.5mM。优选地，当细胞培养物的600nm下的吸光度(OD600)增加到120或大于120时添加IPTG。根据另一实施例，在步骤(iii)中于含有IPTG的第二进料培养基中培养HM11201(KCCM-10660P)(其为经转型以表达免疫球蛋白Fc片段的大肠杆菌菌株)以诱导重组蛋白的表达。如本文所用，术语“转型本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高密度培养表达免疫球蛋白Fc片段的重组大肠杆菌细胞的方法，其包括：(i)在细胞生长培养基中以分批培养模式培养所述大肠杆菌细胞直到所述细胞生长培养基的pH增加0.1或更高；(ii)向步骤(i)中得到的细胞培养物添加第一进料培养基，并且以恒酸度分批进料培养模式培养所述大肠杆菌细胞，直到培养物的600nm吸光度(OD600)达到120至180，其中在步骤(ii)中所述第一进料培养基在400到800rpm速度的搅拌下以200到400ml/hr的速率进给，并且进给速率和搅拌速度逐步增加；(iii)向步骤(ii)中得到的OD600为120至180的细胞培养物添加第二进料培养基，并且以分批进料培养模式培养所述大肠杆菌细胞，其中在步骤(iii)的培养期间所述培养物的pH增加，其中在步骤(iii)中所述第二进料培养基在400到800rpm速度的搅拌下以200到400ml/hr的速率进给，并且进给速率和搅拌速度逐步减小；和(iv)在步骤(iii)期间诱导所述免疫球蛋白Fc片段的表达，其中所述免疫球蛋白Fc片段仅在所述细胞培养物达到150或更高的OD600值时、仅在步骤(iii)中表达；并且其中进行步骤(iii)的培养以获得具有200或更高的最终OD600值的细胞培养物。...

【技术特征摘要】
2012.03.12 KR 10-2012-00252301.一种高密度培养表达免疫球蛋白Fc片段的重组大肠杆菌细胞的方法，其包括：(i)在细胞生长培养基中以分批培养模式培养所述大肠杆菌细胞直到所述细胞生长培养基的pH增加0.1或更高；(ii)向步骤(i)中得到的细胞培养物添加第一进料培养基，并且以恒酸度分批进料培养模式培养所述大肠杆菌细胞，直到培养物的600nm吸光度(OD600)达到120至180，其中在步骤(ii)中所述第一进料培养基在400到800rpm速度的搅拌下以200到400ml/hr的速率进给，并且进给速率和搅拌速度逐步增加；(iii)向步骤(ii)中得到的OD600为120至180的细胞培养物添加第二进料培养基，并且以分批进料培养模式培养所述大肠杆菌细胞，其中在步骤(iii)的培养期间所述培养物的pH增加，其中在步骤(iii)中所述第二进料培养基在400到800rpm速度的搅拌下以200到400ml/hr的速率进给，并且进给速率和搅拌速度逐步减小；和(iv)在步骤(iii)期间诱导所述免疫球蛋白Fc片段的表达，其中所述免疫球蛋白Fc片段仅在所述细胞培养物达到150或更高的OD600值时、仅在步骤(iii)中表达；并且其中进行步骤(iii)的培养以获得具有200或更高的最终OD600值的细胞培养物。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述转型的大肠杆菌菌株为HM11201(KCCM-10660P)。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述转型的大肠杆菌菌株包含携载Lac操纵子的表达载体。4.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(iv)中，所述免疫球蛋白Fc片段的所述表达通过添加异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)来诱导。5.根据权利要求4所述的方法，其中IPTG以0.1到0.5mM的浓度添加...

【专利技术属性】
技术研发人员：许容豪，吴宜林，郑圣烨，权世昌，
申请(专利权)人：韩美科学株式会社，
类型：发明
国别省市：韩国,KR