本发明专利技术公开了一种生产N‑乙酰氨基葡萄糖的谷氨酸棒杆菌及其应用，属于代谢工程领域。本发明专利技术以谷氨酸棒状杆菌S9114作为出发菌株，使用谷氨酸棒杆菌与大肠杆菌的穿梭表达载体pJYW‑4表达了乙酰氨基葡萄糖合成途径中的一个关键酶基因：来源于秀丽隐杆线虫来源的氨基葡萄糖‑6‑磷酸乙酰转移酶GNA1，并通过在GNA1基因的3’非翻译区插入重复性回文序列来加强乙酰氨基葡萄糖合成途径，提高乙酰氨基葡萄糖的产量，得到了产乙酰氨基葡萄糖重组谷氨酸棒杆菌，产量达到6.1g/L，为进一步代谢工程改造谷氨酸棒杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础。
Corynebacterium glutamicus producing N- acetylglucosamine and its application
The invention discloses a Corynebacterium glutamicum producing N_acetylglucosamine and its application, belonging to the field of metabolic engineering. Corynebacterium glutamicum S9114 was used as the starting strain to express a key enzyme gene in the acetaminoglucose biosynthesis pathway by using the shuttle expression vector pJYW_4 between Corynebacterium glutamicum and Escherichia coli: glucosamine_6_phosphate acetyltransferase GNA1 from C. elegans and through GN By inserting repetitive palindromes into the 3'untranslated region of A1 gene to enhance the synthesis pathway of acetaminoglucose and increase the yield of acetaminoglucose, a recombinant Corynebacterium glutamicum producing acetaminoglucose was obtained. The yield reached 6.1g/L, which laid a foundation for further metabolic engineering transformation of Corynebacterium glutamicum to produce glucosamine. Basics.
【技术实现步骤摘要】
一种生产N-乙酰氨基葡萄糖的谷氨酸棒杆菌及其应用
本专利技术涉及一种生产N-乙酰氨基葡萄糖的谷氨酸棒杆菌及其应用，属于代谢工程领域。
技术介绍
N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)是氨基葡萄糖的一种衍生物，具有还原性，也是合成双岐因子和透明质酸的重要前体物质，又称2-(乙酰氨基)-2-脱氧-葡萄糖及N-乙酰葡萄糖胺，是生物体内多种多糖的基本组成单位，在生物体内具有重要的生理功能。G1cNAc是新型的生化药品，在食品、医药和化妆品等领域都具有广泛应用。G1cNAc在自然界中存在范围广泛，尤其是海洋生物类动物的外骨骼中含量最高，所有生物均可以合成GlcNAc。GlcNAc是缔结组织、软骨组织及关节液等的关键组成物质，具有重要的药用效果。GlcNAc在临床上是关节炎类疾病的关键药物，其科学性己经临床试验相继验证。GlcNAc可以提高关节抗炎活性和蛋白活性，其效果好于透明质酸。GlcNAc可以诱导白血病细胞的分化，很可能成为新的低毒、高效的治疗白血的候选药物。同时GlcNAc能够促进人体粘多糖的合成，可以增强人体的抵抗力和人体免疫力。谷氨酸棒杆菌是一种革兰氏阳性菌，它作为一种食品级的微生物已经应用于诸多氨基酸的工业化发酵生产中，如谷氨酸、缬氨酸、赖氨酸等等。近年来学者们开始研究利用谷氨酸棒杆菌生产非氨基酸物质。相比于大肠杆菌来说，谷氨酸棒杆菌具有高安全性，低致病性，高抗逆性，而且受噬菌体污染的概率较低等优点，因此它也基因工程领域发挥着重要作用。在谷氨酸棒状杆菌中因为不存在氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰转移酶，不存在通过葡萄糖合成N－乙酰氨基葡萄糖的途径。因此只有高效表达外源氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰转移酶基因才能使得谷氨酸棒状杆菌具有合成N-乙酰氨基葡萄糖的能力。
技术实现思路
本专利技术通过在谷氨酸棒杆菌中表达氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰转移酶，并在基因3’UTR添加了重复性回文序列以后在不影响谷氨酸棒杆菌生长情况的同时也提高了其GlcNAc产量。本专利技术的第一个目的是提供一种重组谷氨酸棒杆菌，表达氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰转移酶。在本专利技术的一种实施方式中，还在所述重组谷氨酸棒杆菌的GNA1基因终止密码子下游位置添加重复性回文序列，重复性回文序列的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组谷氨酸棒杆菌的出发菌株为谷氨酸棒杆菌S9114。在本专利技术的一种实施方式中，编码所述氨基葡萄糖-6磷酸乙酰化酶的基因如NCBI-GeneID:179437。在本专利技术的一种实施方式中，编码所述氨基葡萄糖-6磷酸乙酰化酶基因通过表达载体pJYW-4进行表达，以启动子Ptac控制葡萄糖-6磷酸乙酰化酶基因的表达。在本专利技术的一种实施方式中，所述启动子Ptac由PTrp启动子和Plac启动子杂合而成，具有更高的转录效率，启动子Ptac的构建过程参见2014年公开的论文ConstructionofanovelexpressionsystemforuseinCorynebacteriumglutamicum.Plasmid75,18-26.。本专利技术的第二个目的是提供一种构建上述谷氨酸棒杆菌工程菌的方法，具体方法如下:(1)构建pJYW-4-ceN(表达GNAI基因)和pJYW-4-ceN-REP(在GNA1基因的3’非翻译区插入重复性回文序列)两个表达载体；(2)将两个表达载体转入宿主菌谷氨酸棒杆菌S9114，得到最终生产N-乙酰氨基葡萄糖的谷氨酸棒杆菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述的葡萄糖乙酰化酶来源于秀丽隐杆线虫。本专利技术的第三个目的是提供一种发酵生产乙酰氨基葡萄糖的方法，应用所述重组谷氨酸棒杆菌进行发酵生产。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵是将28～30℃,220rpm下培养16h的种子以使得发酵培养基的初始OD562为1.6的接种量转入发酵培养基，于28～30℃,220rpm条件下培养72～100h。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵培养基每L含有葡萄糖100.0g，玉米浆10.0g，KH2PO41.0g，(NH4)2SO420.0g，MgSO40.5g，CaCO320.0g,FeSO40.18g,pH7.0。有益效果：本专利技术提供的重组谷氨酸棒杆菌可实现乙酰氨基葡萄糖在胞外积累，其浓度最高可达6.0g/L，为进一步代谢工程改造谷氨酸棒杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础。本专利技术提供的重组谷氨酸棒杆菌构建方法简单，便于使用，具有很好地应用前景。附图说明图1为构建重组pJYW-4-ceN质粒图谱。图2为构建重组pJYW-4-ceN-REP质粒图谱。图3为不同菌株摇瓶发酵的细胞生长情况。图4为不同菌株摇瓶发酵上清液中GlcNAc的产量过程图。图5为发酵条件优化后不同菌株摇瓶发酵的细胞生长情况。图6为发酵条件优化后不同菌株摇瓶发酵上清液中GlcNAc的产量过程图。具体实施方式乙酰氨基葡萄糖的测定方法：高效液相色谱(HPLC)检测法：Agilent1260,RID检测器，HPX-87H柱(Bio-RadHercules,CA)，流动相:5mMH2S04，流速0.6mL/min，柱温35℃，进样体积为10μL。种子活化培养基液体(LBG)(g/L)：蛋白胨10.0，酵母膏5.0，NaCl10.0,葡萄糖5.0，装液量20ml每250ml三角瓶。种子活化培养基固体(LBG固体)(g/L)：蛋白胨10.0，酵母粉5.0，NaCl10.0,葡萄糖5.0，营养琼脂15.0-20.0。感受态培养基(g/L):：蛋白胨10.0，酵母膏5.0，NaCl10.0,甘氨酸30.0，异烟肼4.0，同时加入10ml的Tween80,装液量50ml每500ml三角瓶。电击转化后恢复培养基LBHIS(g/L)：蛋白胨5.0，酵母膏2.5，NaCl5.0,脑心浸液18.5，山梨醇91.0。转化子检出培养基固体(g/L)：蛋白胨5.0，酵母膏2.5，NaCl5.0,脑心浸液18.5，山梨醇91.0,营养琼脂15.0-20.0。种子培养基(g/L)：葡萄糖25.0,玉米浆20.0，KH2PO41.0，(NH4)2SO40.5，尿素1.25，pH7.0。发酵培养基(g/L)：葡萄糖40.0，玉米浆20.0,KH2PO41.0，(NH4)2SO420.0，MgSO40.5，CaCO320.0,pH7.0。优化发酵培养基(g/L)：葡萄糖100.0，玉米浆10.0,KH2PO41.0，(NH4)2SO420.0，MgSO40.5，CaCO320.0,FeSO40.18,pH7.0。灭菌条件：115℃，20min,所有培养基用于转化子检出或用于重组菌培养时加入25mg/L硫卡那霉素。实施例1重组质粒pJYW-4-ceN和pJYW-4-ceN-REP的构建。使用引物cegna1F(核苷酸序列如SEQIDNO.2所示)所示和cegna1R(核苷酸序列如SEQIDNO.3所示)将来自线虫的葡萄糖-6-磷酸乙酰转移酶(GNA1)基因从pP43-HA-ceN-RBS4质粒上扩增下来，使用的酶切位点是PstI和NotI，pP43-HA-ceN-RBS4质粒核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。使用质粒pJYW-4作为表达载体来表达GNA1，pJYW-4具体构建过程参见文献Hu,J.等,(2本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，表达氨基葡萄糖‑6‑磷酸乙酰转移酶；所述氨基葡萄糖‑6‑磷酸乙酰转移酶来源于秀丽隐杆线虫。
【技术特征摘要】
1.一种重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，表达氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰转移酶；所述氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰转移酶来源于秀丽隐杆线虫。2.根据权利要求1所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，编码所述氨基葡萄糖-6磷酸乙酰化酶的基因GeneID为179437。3.根据权利要求1或2所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，还在氨基葡萄糖-6磷酸乙酰化酶基因终止密码子下游位置添加重复性回文序列，重复性回文序列含有如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。4.根据权利要求1～3任一所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，以谷氨酸棒杆菌S9114为出发菌株。5.根据权利要求1～4任一所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，以pJYW-4为载体表达氨基葡萄糖-6磷酸乙酰化酶，以启动子Ptac控制葡萄糖-6磷酸乙酰化酶基因的表达。6.一种...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘龙，堵国成，陈坚，李江华，邓琛，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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