本发明专利技术属于基因工程和微生物代谢工程技术领域，公开了一株高效降解咖啡因的解淀粉芽胞杆菌工程菌及应用，申请人将咖啡因降解的5个基因ndmA，ndmB，ndmC，ndmD和ndmE加上枯草芽胞杆菌168的启动子P43和淀粉酶终止子TamyL，通过同源重组整合解淀粉芽胞杆菌LX‑12的基因组噬菌体位点,筛选后，得到整合菌株解淀粉芽胞杆菌HZ‑12::ndmABCDE，成功实现咖啡因降解。该菌株在500mg/L咖啡因的基础培养基中，对咖啡因的降解率为52.6%，比原始菌株提高31.5%，为低咖啡因茶和咖啡的制作及其废弃物再利用奠定了基础。
An engineered strain of Bacillus amylus which efficiently degrades caffeine and its application
The invention belongs to the field of genetic engineering and microbial metabolism engineering, and discloses a strain of Bacillus amylum engineering bacteria which efficiently degrades caffeine and its application. 5 genes ndmA, ndmB, ndmC, ndmD and ndmE with caffeine degradation are added to the promoter P43 of Bacillus subtilis 168 and the amylase terminator TamyL by the same. The genomic phagocytosis of Bacillus amyloid LX 12 was synthesized by source recombination. After screening, the integrated strain of Bacillus amyloid HZ 12:: ndmABCDE was obtained, and the caffeine degradation was successfully realized. In the basic medium of 500mg/L caffeine, the degradation rate of caffeine was 52.6%, which was 31.5% higher than that of the original strain. It laid the foundation for the production of decaffeinated tea and coffee and the reuse of waste.
【技术实现步骤摘要】
一株高效降解咖啡因的解淀粉芽胞杆菌工程菌及应用
本专利技术属于基因工程和微生物代谢工程
，涉及一株高效降解咖啡因的解淀粉芽胞杆菌工程菌及应用。
技术介绍
咖啡因又称1,3,7-三甲基黄嘌呤，化学式为C8H10N4O2，属于嘌呤碱，广泛存在于茶，咖啡，巧克力，制药产品及多种饮料产品中。长期摄入咖啡因可导致头痛，肾上腺刺激，肌肉活动不规律，心律失常，骨质疏松，并对心脏病患者有不良影响。怀孕期间摄入咖啡因导致胎儿畸形，降低生育率。因而，开发脱咖啡因饮料和食品非常重要。除了对健康的担忧之外，咖啡因给环境的带来很大影响。茶和咖啡产业的固体废弃物如茶渣、咖啡渣、咖啡壳含有高浓度的咖啡因，咖啡因作为主要有毒物质之一，导致这些富含碳水化合物和蛋白质的固体废弃物无法作为饲料或肥料再利用，茶和咖啡加工厂的流出液由于含有高浓度咖啡因，因此不允许流入湖泊河流。研究发现，多种真菌和细菌可降解咖啡因，真菌主要包括曲霉，青霉，根霉等，目前对真菌的研究较少；细菌主要包括假单胞菌株，不动杆菌，产碱杆菌属等，其中恶臭假单胞菌株是研究最多的咖啡因降解菌株。WoolfolkCA从1975年开始研究恶臭假单胞菌降解咖啡因途径。Summers等人于2012，2013年找出恶臭假单胞菌株中降解咖啡因至嘌呤的5个基因，分别为ndmA，ndmB，ndmC，ndmD和ndmE，NdmA和NdmB是两个独立的Rieske非血红素铁单氧酶分别具有N-1和N-3专一脱甲基活性。NdmA和NdmB均依赖从NADH转移电子给Rieske还原酶NdmD。NdmC为N-7专一脱甲基酶,与NdmD和NdmE组成一种新型的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)复合蛋白,催化7-甲基黄嘌呤脱甲基生成黄嘌呤，黄嘌呤再由细胞进一步代谢。恶臭假单胞菌株具有腥臭味，应用在生产低咖啡因茶和咖啡时，对茶和咖啡的风味造成影响，而在解淀粉芽胞杆菌整合表达可解决上述问题；且上述ndmABCDE在恶臭假单胞菌株中诱导表达，当培养基有多种碳氮源时，恶臭假单胞菌株对咖啡因的降解效率降低，不宜工业应用。本专利技术提供的整合菌株解淀粉芽胞杆菌HZ-12::ndmABCDE其整合基因带有强启动子，组成表达咖啡因降解酶达到高效降解咖啡因目的。为生产低咖啡因茶和咖啡以及茶渣等废弃物的再利用奠定基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一株可高效降解咖啡因的解淀粉芽胞杆菌工程菌，所述解淀粉芽胞杆菌于2017年12月18日送至武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2017805，分类命名：解淀粉芽胞杆菌(Bacillus.amyloliquefaciens)HZ-12::ndmABCDE,地址：中国武汉武汉大学。本专利技术的另一个目的在于提供了解淀粉芽胞杆菌HZ-12::ndmABCDE在降解咖啡因中的应用。为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：一株可高效降解咖啡因的解淀粉芽胞杆菌工程菌，申请人通过从已筛选得到的咖啡因降解菌株恶臭假单胞菌株克隆ndmABCDE5个基因，通过SOE，在基因ndmA，ndmB分别加上枯草芽胞杆菌168启动子P43和(淀粉酶)终止子以及各自的上下游同源臂；ndmCDE三个基因串联作为一个整体进行上述操作，利用同源重组的方式将上述5个基因整合到解淀粉芽胞杆菌LX-12(保藏编号为CCTCCNO：M2015234)的噬菌体位点上，再经过阳性筛选，咖啡因降解率的筛选，最终获得了一株高效降解咖啡因的解淀粉芽胞杆菌工程菌，该菌株已于2017年12月18日送至武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2017805，分类命名：解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)HZ-12::ndmABCDE,地址：中国武汉武汉大学。解淀粉芽胞杆菌HZ-12::ndmABCDE在降解咖啡因中的应用，包括利用本领域的常规方式，利用本专利技术提供解淀粉芽胞杆菌HZ-12::ndmABCDE对咖啡因进行降解，或制备成咖啡因降解剂。以上所述的应用中，优选的应用步骤包括：将解淀粉芽胞杆菌HZ-12::ndmABCDE种子液接至发酵培养基中进行发酵培养，所述发酵培养基配方包括：10-60g/L玉米淀粉，10-60g/L硝酸钠，0.5-1g/L咖啡因，0.1-1.5g/LKH2PO4，0.1-1.5g/LMgSO4·7H2O，0.1-1.5g/L无水CaCl2，0.1-1.5g/LNa2HPO4，0.1-1.0g/LFeSO4·7H2O；pH6.0-8.0；发酵培养条件为：发酵温度为30-40℃，装液量为容器体积的10-30％，摇床转速200-260rpm，发酵周期34-38h。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：恶臭假单胞菌株由于具有腥臭味，不宜应用在制作低咖啡因茶和咖啡上；且其以多种碳氮源作为营养物质，咖啡因降解酶为诱导酶，应用在茶和咖啡的固体废弃物如茶渣脱咖啡因上时，不能专一利用咖啡因，效果甚微。将恶臭假单胞菌株的咖啡因降解相关基因加上强启动子，在解淀粉芽胞杆菌中组成表达脱甲基酶，可有效解决上述问题。整合菌株优化后咖啡因降解率为52.6％，比亲本菌株提高了31.5％，对脱咖啡因茶叶，咖啡的生产和含高浓度咖啡因固体废弃物再利用具有重要意义。附图说明图1为ndmA，ndmB，ndmCDE基因琼脂糖电泳图。其中，泳道M：DL5000DNA分子量Maker；泳道1：基因ndmA扩增产物(片段长度1056bp)；泳道2：基因ndmB扩增产物(片段长度1068bp)；泳道3：基因ndmCDE扩增产物(片段长度3331bp)。图2为解淀粉芽胞杆菌HZ-12::ndmABCDE中，利用双交换引物验证的5个基因整合琼脂糖电泳图。其中，泳道M：DL5000DNA分子量Maker；泳道1：ndmA双交换引物在野生菌株中的扩增产物(片段长度1821bp)；泳道2：ndmA双交换引物在整合菌株中的扩增产物(片段长度3021bp)；泳道3：ndmB双交换引物在野生菌株中的扩增产物(片段长度1722bp)。泳道4：ndmB双交换引物在整合菌株中的扩增产物(片段长度3010bp)；泳道5：ndmCDE双交换引物在野生菌株中的扩增产物(片段长度3026bp)。泳道6：ndmCDE双交换引物在整合菌株中的扩增产物(片段长度5371bp)。图3为整合ndmA所构建载体T2ndmA质粒图谱。图4为解淀粉芽胞杆菌HZ-12::ndmABCDE和起始菌株在发酵培养基中发酵终点测定的咖啡因降解率图。具体实施方式本专利技术所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。实施例1：解淀粉芽胞杆菌HZ-12::ndmABCDE的获得：1.重组载体中表达元件的克隆上述ndmA整合所用上游同源臂ndmA-up是以解淀粉芽胞杆菌LX-12(保藏编号为CCTCCNO：M2015234)的总DNA为模板，通过PCR的方法扩增出ndmA-up的序列SEQIDNO:1，引物分别为ndmA-upF/R，序列SEQIDNO:2和SEQIDNO:3；启动子P43是以枯草芽胞杆菌168的总DNA为模板，采用PCR的方法扩增出启动子P43的序列SEQIDNO:4，引物分别为P43本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种解淀粉芽胞杆菌，其特征在于：所述解淀粉芽胞杆菌的保藏编号为CCTCC No:M2017805，分类命名为：解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciensHZ‑12::ndmABCDE。
【技术特征摘要】
1.一种解淀粉芽胞杆菌，其特征在于：所述解淀粉芽胞杆菌的保藏编号为CCTCCNo:M2017805，分类命名为：解淀粉芽胞杆菌BacillusamyloliquefaciensHZ-12::ndmABCDE。2.权利要求1所述的解淀粉芽胞杆菌在降解咖啡因中应用。3.权利要求1所述的解淀粉芽胞杆菌在制备咖啡因降解剂中的应用。4.利用权利要求1所述的解淀粉芽胞杆菌高效降解咖啡因的方法，其步骤包括：（1）将解淀粉芽胞杆菌BacillusamyloliquefaciensHZ-12::ndmABCDE种子培养液接至发酵培养基中进行发酵培养，所述发酵培养基配方为：10-60g...
【专利技术属性】
技术研发人员：冀志霞，蒋雅利，黄友谊，陈守文，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42
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