一株减毒铜绿假单胞菌的构建方法及其在蛋白质转染中的应用技术

一株减毒铜绿假单胞菌的构建方法及其在蛋白质转染中的应用。构建方法是，将铜绿假单胞菌Δ8菌株中参与细胞壁肽聚糖合成的谷氨酸消旋酶基因murI删除，从而获得D‑谷氨酸营养缺陷型菌株Δ9。其应用是，Δ9菌株无细胞毒性并保留有完好的III型分泌系统(T3SS)，可将外源蛋白质通过其T3SS高效地注入到哺乳动物细胞中，能够应用于哺乳动物细胞蛋白质转染。Δ9在缺少D‑谷氨酸的培养环境中无法生长，因此，转染后该菌可通过D‑谷氨酸营养限制自行清除。我们分别利用HeLa细胞和小鼠感染模型阐释了该菌体外和体内应用的安全性。本发明专利技术对于开发安全、高效的哺乳动物细胞蛋白质转染技术有着积极的意义。

Construction of an attenuated Pseudomonas aeruginosa and its application in protein transfection

Construction of an attenuated Pseudomonas aeruginosa and its application in protein transfection. The construction method was to delete the glutamic acid racemase gene murI from Pseudomonas aeruginosa strain delta 8 in the cell wall peptidoglycan synthesis, so as to obtain the D glutamic acid deficiency strain delta strain, delta 9. Its application is that the delta 9 strain has no cytotoxicity and has a good III type secretory system (T3SS), which can be efficiently injected into mammalian cells through its T3SS, and can be applied to protein transfection in mammalian cells. 9 could not grow in the absence of D_glutamicacid in the culture environment, so the bacteria could be cleared by themselves through D_glutamicacid nutritional restriction after transfection. We used HeLa cells and mouse infection models to explain the safety of the bacteria in vitro and in vivo. The invention has positive significance for developing safe and efficient mammalian cell protein transfection technology.

【技术实现步骤摘要】
一株减毒铜绿假单胞菌的构建方法及其在蛋白质转染中的应用
本专利技术属于生物
，涉及一株减毒铜绿假单胞菌的构建方法及其在哺乳细胞蛋白质转染方面的应用。
技术介绍
铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)为革兰氏阴性菌，这类细菌细胞壁的主要成分是肽聚糖，是原核生物细胞所特有的物质。肽聚糖由聚糖骨架、四肽侧链和五肽交联桥三部分组成。聚糖骨架由N-乙酰葡糖胺(N-acetylglucosamine，GlcNAc)和N-乙酰胞壁酸(N-acetylmuramicacid，MurNAc)交替间隔排列，经β-1,4糖苷键联结而成。四肽侧链由L-丙氨酸、D-谷氨酸、L-赖氨酸和D-丙氨酸依次排列组成；第三位的L-赖氨酸由5个甘氨酸组成的五肽交联桥连接到相邻聚糖骨架四肽侧链末端的D-丙氨酸，从而构成机械强度十分坚韧的三维立体结构。D-谷氨酸掺入到四肽侧链的第二个残基上在原核生物中是高度保守的。功能性D-谷氨酸(D-Glu)是由MurI通过改变同名L-谷氨酸立体化学式结构生成的。MurI是一类不需辅助因子，专一催化L型和D型谷氨酸之间相互转化的酶，为细胞壁合成提供D-谷氨酸，是细菌生长的关键酶。通过对铜绿假单胞菌的基因组分析可知，MurI由单一的murI基因编码。对细菌细胞壁合成所需的酶的编码基因murI进行突变，从而使细菌不能形成完整的细胞壁，逐渐导致细菌消亡。铜绿假单胞菌PAK具有III型分泌系统(T3SS)，它是一种锚定在细菌表面的针状复合结构，细菌利用该系统能够将自身的毒力蛋白ExoS、ExoT和ExoY高效地注入到宿主细胞体内，是自然界存在的一种高效的蛋白质注入机制。铜绿假单胞菌之所以具有较强的感染能力和致病能力，也与这些毒素蛋白注入靶细胞息息相关。由于细菌的T3SS是一种高效、快速的蛋白质分泌系统，已被广泛应用于哺乳动物细胞的蛋白质转染。然而，通过细菌T3SS对哺乳动物细胞进行蛋白质转染后，如何将细菌彻底清除就成为重要的课题。在细菌感染细胞的模型中，细菌与细胞长时间的接触，仍然会产生较大的细胞毒性，因此必须将细胞中的细菌除去。目前，通过细菌T3SS对哺乳动物细胞进行蛋白质转染后，大多数采用抗生素对细菌进行清除。前期研究表明，高浓度抗生素(如环丙沙星)的使用对多能干细胞(如人胚胎干细胞)的转录组有显著性影响，虽然尚未有证据表明这种影响会导致其细胞干性的丧失，但抗生素杀菌所产生的副作用不容忽视。因此我们将进一步优化这种蛋白质转染系统，构建低浓度抗生素或者无抗生素处理即可自行清除的蛋白质转染菌株。
技术实现思路
本专利技术的目的是解决细菌利用其T3SS对哺乳动物细胞进行蛋白质转染后，如何将细菌彻底清除的问题，进而构建一种D-谷氨酸营养缺陷的减毒铜绿假单胞菌基因工程菌株，该菌在缺失D-谷氨酸的环境中生长受到限制，但仍具备正常的生理功能，这些细菌可以通过其T3SS对靶细胞进行蛋白质转染，而后由于无法合成新的细胞壁而最终死亡。该专利技术通过营养限制策略解决了蛋白质转染菌株的清除问题，降低了细菌毒力的同时提升了蛋白质转染量，使细菌T3SS介导的蛋白质转染技术更为安全、高效。本专利技术的技术方案一株减毒铜绿假单胞菌的构建方法，该方法包括：将铜绿假单胞菌Δ8菌株基因组中参与细胞壁肽聚糖合成的谷氨酸消旋酶基因murI删除，获得营养缺陷型减毒菌株Δ9；该菌对哺乳动物细胞无细胞毒性，在不添加外源的D-谷氨酸时无繁殖能力，能够通过D-谷氨酸营养缺陷限制抑制细菌的增殖；Δ9菌株的III型分泌系统具有完整功能，能够在短时间内实施对哺乳动物细胞的蛋白质转染。本专利技术构建的菌株Δ9在补充10mMD-谷氨酸的培养基中可正常生长；而不添加外源的D-谷氨酸时，细菌无法繁殖。在D-谷氨酸营养限制条件下，以108CFU的Δ9菌株感染哺乳动物细胞4小时后无显著的细胞毒性产生；用PBS洗细胞三次，残留细菌经10μg/mL环丙沙星或青霉素-链霉素(双抗)处理15小时可彻底清除。由于哺乳动物体内环境无D-谷氨酸，以108CFU的Δ9感染小鼠，12小时后，小鼠各器官内细菌的存活率几乎为零，且在小鼠体内引起的炎症反应较弱。本专利技术构建的菌株Δ9具有完整的III型分泌系统，Δ9菌株在无D-谷氨酸培养基中仍保留完好的III型蛋白质分泌功能，在接触到哺乳动物细胞的时候细菌的III型分泌被激活，能够高效地向哺乳动物细胞内注入效应蛋白。本专利技术同时提供了一种减毒铜绿假单胞菌Δ9菌株的应用，所述的工程菌株Δ9能够应用于哺乳动物细胞蛋白质转染，即通过将目标蛋白与III型分泌系统信号肽ExoS54融合表达于表达载体pExoS54F中，当携带有该表达载体的Δ9菌株与哺乳动物细胞共同培养的时候，Δ9的III型分泌系统被激活，目标蛋白与ExoS54融合表达，从而通过III型分泌系统的针状复合物被注入到哺乳动物细胞当中。所述的目标蛋白为转录因子，酶，疫苗，结构蛋白或效应因子。所述的工程菌株Δ9能够应用于各种哺乳动物细胞系的蛋白质转染，所述的细胞系包括人和鼠的皮肤细胞、肌细胞、肠道细胞、肝细胞、免疫细胞、胚胎干细胞和诱导性多能干细胞。所述的工程菌株Δ9还能够应用于体内的蛋白质转染。本专利技术的优点和有益效果本专利技术构建的菌株Δ9具有完整的T3SS，Δ9菌株在无D-谷氨酸培养基中仍保留完好的III型蛋白质分泌功能，在接触到哺乳动物细胞的时候细菌的T3SS被激活，能够高效地向哺乳动物细胞内注入效应蛋白。本专利技术利用减毒铜绿假单胞菌T3SS作为一种蛋白质转染的工具，既能够简单、高效地将外源蛋白质注入到哺乳动物细胞内，又很容易将残留的细菌清除掉，是一种安全有效的蛋白质注入工具。【附图说明】图1.LDH法检测菌株Δ9对哺乳动物细胞系的细胞毒性。图2.基因工程菌株Δ9体外的生长和存活率。图3.基因工程菌株Δ9在小鼠体内的生长和存活率，a.定植在肺部的细菌数，b.定植在脾脏的细菌数，c.定植在肝脏的细菌数。图4.基因工程菌株Δ9在小鼠体内的炎症反应，a.感染后脾脏中炎症因子IL-1β，IL-6，IL-12b和TNFα的基因表达水平，b.感染后肺中炎症因子IL-1β，IL-6，IL-12b和TNFα的基因表达水平。图5.HeLa细胞中Cre重组酶的转染量，a.WesternBlot检测细胞内的Cre蛋白，b.对WesternBlot的定量柱状图。【具体实施方式】本专利技术使用的菌种和质粒铜绿假单胞菌PAK和Δ8(PAK-J背景下敲除染色体上的exoS、exoT、exoY、ndk、popN、rhlR-I,、lasR-I和xcpQ基因)为实验室保存；大肠杆菌DH5α/λpir用于分子克隆，本实验室保存；大肠杆菌S17-1/λpir用于接合转移，本实验室保存；基因敲除载体pEX18Tc，融合蛋白表达载体pExoS54F，本实验室保存。本专利技术使用的哺乳动物细胞Hela细胞为本实验室保存。本专利技术使用的实验动物：雌性BALB/c小鼠(6-8周大小)购自维通利华公司，许可证编号SYXK(津)2014-0003，保证12h光照-黑暗循环环境，所有的程序和实验均遵循国际接受的实验动物饲养使用标准。本专利技术使用的试剂DNAMarker、限制性内切酶、TaqDNA聚合酶、dNTP来自于Takara公司；T4DNA连接本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株减毒铜绿假单胞菌的构建方法，其特征在于：将铜绿假单胞菌Δ8菌株基因组中参与细胞壁肽聚糖合成的谷氨酸消旋酶基因murI删除，获得营养缺陷型减毒铜绿假单胞菌菌株Δ9；该菌对哺乳动物细胞无细胞毒性，在不添加外源的D‑谷氨酸时无繁殖能力，能够通过D‑谷氨酸营养缺陷限制抑制细菌的增殖；Δ9菌株的III型分泌系统具有完整功能，能够在短时间内实施对哺乳动物细胞的蛋白质转染。

【技术特征摘要】
1.一株减毒铜绿假单胞菌的构建方法，其特征在于：将铜绿假单胞菌Δ8菌株基因组中参与细胞壁肽聚糖合成的谷氨酸消旋酶基因murI删除，获得营养缺陷型减毒铜绿假单胞菌菌株Δ9；该菌对哺乳动物细胞无细胞毒性，在不添加外源的D-谷氨酸时无繁殖能力，能够通过D-谷氨酸营养缺陷限制抑制细菌的增殖；Δ9菌株的III型分泌系统具有完整功能，能够在短时间内实施对哺乳动物细胞的蛋白质转染。2.根据权利要求1所述的减毒铜绿假单胞菌的构建方法，其特征在于：以108CFU的Δ9菌株感染哺乳动物细胞4小时无显著的细胞毒性产生。3.根据权利要求1所述的减毒铜绿假单胞菌的构建方法，其特征在于：菌株Δ9在补充10mMD-谷氨酸的培养基中可正常生长；而不添加外源的D-谷氨酸时，细菌无法繁殖；在D-谷氨酸营养限制条件下，以108CFU的Δ9菌株感染HeLa细胞4小时后，用PBS洗去浮游细菌，残留细菌经抗生素处理15小时可彻底清除。4.根据权利要求1所述的减毒铜绿假单胞菌的构建方法，其特征在于：由于哺乳动物体内环境无D-谷氨酸，以108CFU的Δ9菌株感染小鼠，12小时后，小鼠各器官内细菌的存活率几乎为零，且在小鼠体内引起的炎症反应较弱。5.根据权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：白芳，刘颖，吴卫辉，靳永新，程志晖，刘畅，许译天，郑瑞萍，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：天津,12