免疫球蛋白FC变体制造技术

本发明专利技术涉及具有增加的FcRn结合亲和力的免疫球蛋白Fc变体，其特征在于包括选自天然免疫球蛋白Fc片段的恒定区中的307S、308F、380S、380A、428L、429K、430S、433K和434S(该编号是根据EU索引)的一个或更多个氨基酸修饰。由于高的FcRn结合亲和力，根据本发明专利技术的免疫球蛋白Fc变体显示更延长的体内半衰期，并且因此可用于制备蛋白质药物的长效剂型。

Immunoglobulin FC variant

The present invention relates to an immunoglobulin Fc variant with an increased FcRn binding affinity, characterized by one or more amino acid modifications including 307S, 308F, 380S, 380A, 428L, 429K, 430S, 433K and 434S (the number is based on the EU index) selected from the constant region of the natural immunoglobulin Fc fragment. Because of the high binding affinity of FcRn, the immunoglobulin Fc variant according to the present invention shows a longer in vivo half-life, and therefore can be used to prepare long-acting dosage forms of protein drugs.

【技术实现步骤摘要】
免疫球蛋白FC变体本申请是分案申请，原申请的申请日为2012年12月28日，中国申请号为201280066663.2，国际申请号为PCT/KR2012/011739，专利技术名称为“免疫球蛋白FC变体”。
本专利技术涉及具有增加的FcRn(新生Fc受体)结合亲和力的免疫球蛋白Fc变体和使用其增加生理学活性多肽的体内半衰期的方法。本专利技术的免疫球蛋白Fc变体特征在于包括选自天然免疫球蛋白Fc片段的恒定区中的307S、308F、380S、380A、428L、429K、430S、433K和434S(该编号是根据EU索引)的一个或更多个氨基酸修饰。
技术介绍
抗体是结合具体抗原的免疫蛋白。抗体由两条多肽轻链和两条多肽重链组成。每条链由免疫球蛋白结构域组成并且都具有可变区和恒定区。抗体之间的可变区显示明显的序列多样性并且负责结合靶抗原。具有相对低的序列多样性的恒定区负责结合许多天然蛋白并且引发重要的生物化学事件。在许多之前的文献中公开了抗体的结构、功能和亚类的详细描述(BurtonDR:ImmunoglobulinG:functionalsites,Mol.Immunol.22:161-206,1985)。IgG中Fc结构域之间的区域介导与新生Fc受体(FcRn)的相互作用。FcRn捕获通过内吞作用进入细胞的IgG并且使其从内体循环回至血流(Raghavan等,Annu.Rev.CellDev.Biol.12：181-220,1996)。由于抗体本身的大尺寸，利用肾过滤的排阻，该过程产生范围从一周至三周的延长的抗体血清半衰期。大鼠和人Fc结构域的研究已经表明了一些Fc残基对FcRn结合的重要性。在鼠Fcγ结构域中，在位点T252、T254和T256处的随机突变和噬菌体展示选择产生三重突变体T252L/T254S/T256F，其具有增加的FcRn结合亲和力和血清半衰期(Ghetie等,Nat.Biotech.15(7):637-640,1997)。通过在位点I253、H310和H435处的突变，Fc/FcRn相互作用的破坏也导致下降的体内半衰期(Medesan等,J.Immunol.158(5):2211-2217,1997)。已经证明对于结合FcRn重要的人Fcγ结构域的一些残基的突变增加血清半衰期。尤其，在人Fcγ1中，当三个残基被其他19个常规氨基酸替代时，一些点突变显示增加的FcRn结合亲和力(Hinton等,J.Biol.Chem.279(8):6213-6216,2004)。已知Fc的氨基酸，H310和H435，以及L309和I253主要通过盐桥和疏水键参与结合FcRn。也报道了T250、M252、S254、T256、V308、E380、M428和N434中的突变增加或降低FcRn结合亲和力(Roopenian等,Nat.RviewImmunology7:715-725,2007)。韩国专利号10-1027427公开了具有增加的FcRn结合亲和力的曲妥珠单抗(赫赛汀，Genentech)变体，并且这些变体包含选自257C、257M、257L、257N、257Y、279Q、279Y、308F和308Y的一个或更多个氨基酸修饰。韩国专利公开号2010-0099179提供了贝伐单抗(阿瓦斯汀，Genentech)变体并且这些变体通过包含在N434S、M252Y/M428L、M252Y/N434S和M428L/N434S的氨基酸修饰显示增加的体内半衰期。考虑蛋白质的清除和体内半衰期性质，抗体蛋白作为治疗剂的施用需要以规定频率注射。更长的体内半衰期允许较不频繁的注射或更低的剂量，其每一种明显是有优势的。尽管以前报道的Fc结构域中的突变产生具有增加的FcRn结合亲和力和延长的体内半衰期的一些抗体变体，但是发现这些突变不是最佳的，并且一些变体未使体内半衰期提高至满意的水平。同时，增加体内半衰期的需要不是限于抗体蛋白的问题。治疗性蛋白，包括低分子量多肽、细胞因子和激素，由于低的稳定性容易变性，被血液中的蛋白水解酶降解，并且最终通过肾或肝脏的作用去除。所以，包括多肽作为药学上活性成分的蛋白质药物应频繁施用至患者，以便维持它们的最佳血液浓度和效价。然而，由于大部分蛋白质药物以可注射的剂型被施用至患者，用于维持活性多肽的最佳血液浓度的频繁注射引起巨大的疼痛。为了解决这些问题，已经尝试连接比如PEG的聚合物或融合比如白蛋白的蛋白质以增加多肽药物的体内半衰期。然而，即使其连接PEG或其融合白蛋白，该多肽药物仍显示相对低的生物学活性或其体内半衰期不能增加至足够的水平。韩国专利号10-0567902公开了一种通过体外将免疫球蛋白片段与非肽基聚合物连接制备的缀合物。在该方法中，仅免疫球蛋白片段在大肠杆菌中产生，并且然后通过该非肽基聚合物连接至生理学活性多肽，其通过使其活性下降最小化导致延长多肽的半衰期。该方法已经视为可应用至在自然中未发现的非天然的或合成的生理学活性物质，以及应用至天然肽和蛋白质的一般技术。然而，仍需要使包括肽和蛋白质的治疗性生理学活性物质的体内半衰期最大化。因此，本专利技术人已经开发了与天然免疫球蛋白Fc片段相比具有增加的FcRn结合亲和力的免疫球蛋白Fc变体。他们也发现，其中本专利技术的免疫球蛋白Fc变体经非肽基聚合物共价连接至生理学活性多肽的蛋白缀合物由于增加的FcRn结合亲和力显示更延长的体内半衰期。
技术实现思路
技术问题本专利技术的目的是提供具有增加的FcRn结合亲和力的免疫球蛋白Fc变体。本专利技术的另一个目的是提供包括本专利技术的免疫球蛋白Fc变体的蛋白缀合物。本专利技术的仍另一个目的是提供通过使用本专利技术的免疫球蛋白Fc变体增加生理学活性多肽的体内半衰期的方法。技术方案在一方面中，本专利技术提供了具有增加的FcRn结合亲和力的免疫球蛋白Fc变体，其包括选自天然免疫球蛋白Fc片段的恒定区中的307S、308F、380S、380A、428L、429K、430S、433K和434S(该编号是根据EU索引)的一个或更多个氨基酸修饰。在另一方面中，本专利技术提供了具有增加的体内半衰期的蛋白缀合物，其中生理学活性多肽经非肽基聚合物共价连接至根据本专利技术的免疫球蛋白Fc变体。在仍另一方面中，本专利技术提供了增加生理学活性多肽的体内半衰期的方法，其包括经非肽基聚合物共价连接根据本专利技术的免疫球蛋白Fc变体至生理学活性多肽的步骤。专利技术的有利效果因为根据本专利技术的免疫球蛋白Fc变体显示高的FcRn结合亲和力，所以它们可增加生理学活性多肽的体内半衰期。因此，具有延长的体内半衰期的蛋白缀合物——其中本专利技术的免疫球蛋白Fc变体经非肽基聚合物共价连接至生理学活性多肽，可有效地用于制备具有显著低的施用频率的蛋白质药物的长效剂型。附图说明图1至3是分析根据本专利技术的免疫球蛋白Fc变体的FcRn结合亲和力的ELISA结果，其中左图代表在pH6.0下的结合亲和力，和右图代表在pH7.4下的结合亲和力；和图4是分析根据本专利技术的蛋白缀合物的FcRn结合亲和力的ELISA结果，其中通过经非肽基聚合物连接免疫球蛋白Fc变体和生理学活性多肽制备蛋白缀合物，左图代表在pH6.0下的结合亲和力，和右图代表在pH7.4下的结合亲和力。最佳实施方式在本专利技术的一方面中，本专利技术涉及具有增加的FcRn结本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.蛋白缀合物，其中生理学活性多肽经由非肽基聚合物共价连接至免疫球蛋白Fc变体，其中所述免疫球蛋白Fc变体包括在野生型免疫球蛋白Fc片段的恒定区中的氨基酸修饰428L/434S(该编号是根据EU索引)。

【技术特征摘要】
2011.12.30 KR 10-2011-01476831.蛋白缀合物，其中生理学活性多肽经由非肽基聚合物共价连接至免疫球蛋白Fc变体，其中所述免疫球蛋白Fc变体包括在野生型免疫球蛋白Fc片段的恒定区中的氨基酸修饰428L/434S(该编号是根据EU索引)。2.根据权利要求1所述的蛋白缀合物，其中所述蛋白缀合物与包括野生型免疫球蛋白Fc片段的蛋白缀合物相比具有增加的体内半衰期和FcRn结合亲和力。3.根据权利要求1所述的蛋白缀合物，所述免疫球蛋白Fc变体包括下列氨基酸修饰：所述野生型免疫球蛋白Fc片段的所述恒定区中在428位的甲硫氨酸被亮氨酸替代和在434位的天冬酰胺被丝氨酸替代；并且具有由SEQIDNO:74表示的氨基酸序列。4.根据权利要求1所述的蛋白缀合物，其中所述非肽基聚合物选自聚乙二醇单聚合物、聚丙二醇单聚合物、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙烯化的多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚、生物可降解聚合物、脂聚合物、几丁质、透明质酸和其组合。5.根据权利要求1所述的蛋白缀合物，其中所述生理学活性多肽选自人生长激素、生长激素释放激素、生长激素释放肽、干扰素、集落刺激因子、白介素、可溶性白介素受体、可溶性TNF受体、葡糖脑苷脂酶、巨噬细胞活化因子、巨噬细胞肽、B细胞因子、T细胞因子、蛋白A、过敏抑制剂、细胞坏死糖蛋白、免疫毒素、淋巴毒素、肿瘤坏死因子、肿瘤抑制剂、转移生长因子、α-1抗胰蛋白酶、白蛋白、载脂蛋白-E、促红细胞生成素、高糖基化的促红...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴宜林，许容豪，黄祥渊，崔仁荣，郑圣烨，权世昌，
申请(专利权)人：韩美科学株式会社，
类型：发明
国别省市：韩国,KR