一种具有靶向光热效应的智能响应性纳米粒子的制备方法技术

本发明专利技术涉及医用材料领域，公开了一种具有靶向光热效应的智能响应性纳米粒子的制备方法，本发明专利技术首先使用羧基化胆固醇和蛋黄卵磷脂制备得到具有pH敏感的脂质体膜；然后以脂质体膜为聚合模板，温度敏感的异丙基丙烯酰胺为单体，N，N‑亚甲基双丙烯酰胺为交联剂，通过模板原位聚合方法制备出一种新型的pH和温度双敏感的纳米药物递送载体；然后再将氧化石墨烯与叶酸、1‑乙基‑(3‑二甲氨基丙基)碳化二亚胺、氮‑羟基琥珀酰亚胺反应得到叶酸@石墨烯；最后再将叶酸@石墨烯负载于脂质体凝胶上，得到最终产物。该方法制备的脂质体凝胶将在后期可实现靶向性、肿瘤热疗和化疗的协同效应，增加聚合物材料的稳定性，有望用于癌细胞治疗。

A preparation method of smart responsive nanoparticles with targeted photothermal effect

【技术实现步骤摘要】
一种具有靶向光热效应的智能响应性纳米粒子的制备方法
本专利技术涉及医用材料领域，尤其涉及一种具有靶向光热效应的智能响应性纳米粒子的制备方法。
技术介绍
近年来，癌症已成为危害人类健康最大的疾病之一，而化疗是各种癌症最常见的治疗方式之一。目前临床用治疗肿瘤的药物大多为小分子化疗药物，然而小分子抗癌药物不但能进入肿瘤部位，而且很容易渗透到正常组织和器官。由于抗癌药物对癌细胞的选择性低，在肿瘤的临床上有效的细胞毒性所需的药物剂量，往往会严重损害周围健康的细胞，导致不良的副作用。而且小分子化疗药物的药效也受到多种耐药性的影响。因此，对于肿瘤形成及治疗方法的研究，目前己经成为研究人员的研究重点和热点。近年来，生物医学与纳米技术的结合为癌症的治疗带来了新机遇。具有独特的光学、磁学、电学和声学等理化性质的纳米药物为重大疾病的预防、诊断和治疗带来了新思路。其中，聚合物纳米材料具有优良的生物相容性和降解性、可设计的尺寸和表面性能、较高的载药量和药物递送效率、良好的循环稳定性和EPR效应，从而提高药物的生物利用度，实现高效的药物靶向和控制释放。因此，聚合物纳米材料被广泛应用于药物递送系统。随着聚合物纳米材料作为药物载体在生物医药方面的广泛应用，设计和构建能够有效输送抗癌药物至癌变部位，并控制药物释放速率、维持血药浓度、减小药物毒副作用等的药物载体是临床医学非常重要的研究内容。而纳米药物载体凭着其独特的性能，在解决这一问题方面有着极具广阔的前景。各种药物载体能对药物进行靶向运输和控制释放，提高抗癌药物在肿瘤组织或肿瘤细胞中的积累，降低系统毒性，增加药物的耐受剂量，实现增溶、增效和减毒的目的。如何让聚合物纳米材料同时兼具靶向性、肿瘤热疗和化疗的协同效应，改善其在药物靶向和代谢稳定性方面的不足等问题已成为关注的焦点。因此，研究一种同时兼具靶向性、肿瘤热疗和化疗协同效应的聚合物纳米材料迫在眉睫。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种具有靶向光热效应的智能响应性纳米粒子的制备方法，本专利技术首先使用羧基化胆固醇和蛋黄卵磷脂制备得到具有pH敏感的脂质体膜；然后以脂质体膜为聚合模板，温度敏感的异丙基丙烯酰胺为单体，N，N-亚甲基双丙烯酰胺为交联剂，通过模板原位聚合方法制备出一种新型的pH和温度双敏感的纳米药物递送载体；然后再将氧化石墨烯与叶酸、1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺、氮-羟基琥珀酰亚胺反应得到叶酸@石墨烯；最后再将叶酸@石墨烯负载于脂质体凝胶上，得到最终产物。该方法制备的脂质体凝胶将在后期可实现靶向性、肿瘤热疗和化疗的协同效应，增加聚合物材料的稳定性，有望用于癌细胞治疗。本专利技术的具体技术方案为：一种具有靶向光热效应的智能响应性纳米粒子的制备方法，其特征在于：以μmol、mmol、mL、mg和g计，包括以下步骤：1)取40～50μmol蛋黄卵磷脂和13～15μmol胆固醇琥珀酸单酯，用2～4mL三氯甲烷溶解，采用旋转蒸发法将溶剂除去，得到一层无色透亮的薄膜，真空干燥，得到干燥脂质体膜。在步骤1)中，在用旋转蒸发后又采用真空干燥是为了在不污染样品的情况下使溶剂完全挥发。2)取500～550mg异丙基丙烯酰胺，50～55mgN，N-亚甲基双丙烯酰胺，5～8mg偶氮二异丁脒盐酸盐和260～280mmol硫酸铵，用5～8mL去离子水溶解，配制成水凝胶预聚物水溶液。在步骤2)中，异丙基丙烯酰胺作为温敏单体，N，N-亚甲基双丙烯酰胺为交联剂，采用偶氮二异丁脒盐酸盐、硫酸铵双引发剂体系，使得反应快速得到温敏性凝胶。3)通过手摇法使步骤1)所得干燥脂质体膜脱落溶解到步骤2)所得水凝胶预聚物水溶液中，在冰水浴下超声处理，形成由脂质体囊泡和纳米凝胶预聚物水溶液组成的混合溶液。4)在步骤3)所得混合溶液中加入抗坏血酸50～70mg，抽真空后通入氮气，重复3～5次；转移至氮气氛围的密封反应装置中，于45～50℃水浴中反应70～90min，并将反应后的溶液置于透析袋中透析去除未反应的杂质。在步骤4)中，采用抗坏血酸作为阻聚剂，可阻止脂质体囊泡外部发生聚合。反复抽真空通氮气可得到较为密闭的反应环境，有利于反应进行。5)先后用200nm、100nm孔径大小的脂质体挤出器挤出透析所得溶液，得到双敏感脂质体纳米凝胶溶液。在步骤5)中，分别用孔径100nm和200nm的挤出器得到的粒子更容易被细胞胞吞。6)取50～60mg氧化石墨烯加入50～60mL蒸馏水，在冰浴条件下超声振荡使氧化石墨片层剥落，获得棕黄色的分散液，将分散液在1000～12000r/min下离心15～25min，收集棕黄色上清液，将沉淀再次加入蒸馏水中，重复上述步骤，合并上清液得到氧化石墨烯水溶液。在步骤6)中，对氧化石墨烯进行超声粉碎，即可得到纳米尺寸的氧化石墨烯，同时对沉淀进行多次超声，使得氧化石墨烯的尺寸分布较为均匀。7)将步骤6)所得氧化石墨烯水溶液，用蒸馏水进行透析，取滤液即为纯化后的氧化石墨烯分散液。在步骤7)中，对氧化石墨烯水溶液进行透析，可以除去杂质，得到较为纯净的溶液。8)将步骤7)所得氧化石墨烯分散液，超声分散均匀，加入5～7g氢氧化钠、5～7g次氯酸钠，超声浴1～3h，将氧化石墨烯片层上的羟基转化为羧基；反应完全后，用稀盐酸中和并反复漂洗，经过离心处理，收集上层的黑色溶液，并用去离子水透析40～50h，除去未反应的水溶性物质。在步骤8)中，将氧化石墨烯与氢氧化钠、次氯酸钠反应，使氧化石墨烯上的羟基转化为羧基，有利于接下来与叶酸上的氨基发生反应；使用稀盐酸洗涤是为了保证样品始终为中性；透析处理是为了得到浓度和纯度较高的溶液。9)向步骤8)所得溶液中加入0.5～0.8g叶酸，超声分散均匀，边搅拌边加入125～127mg1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺和182.5～184.5mg氮-羟基琥珀酰亚胺，超声2～3h后用pH＝7.8-8.2的碳酸氢钠溶液进行透析处理，每3-5h换一次水，40～50h后完成透析，得到黑色溶液。在步骤9)中，1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺和氮-羟基琥珀酰亚胺作为交联剂，作用为活化氧化石墨烯，使其与叶酸充分反应，通过将叶酸连接于聚合物微粒表面，增加其与受体的结合性，使负载药物的聚合物微粒大量聚集于对象细胞表面；使用碳酸氢钠作为透析液是为了保证溶液处于中性条件。10)采用旋转蒸发法去除黑色溶液中的水分，用丙酮反复洗涤，真空干燥，得到叶酸修饰的氧化石墨烯。在步骤10)中，采用丙酮反复洗涤是为了降低溶液zeta电位，使其接近合成环境。11)将步骤10)所得叶酸修饰的氧化石墨烯与步骤5)所得双敏感脂质体纳米凝胶溶液共混，避光搅拌8～12h，离心洗涤、冷冻干燥，得到最终产物。作为优选，步骤11)中，所述叶酸修饰的氧化石墨烯与双敏感脂质体纳米凝胶溶液的用量比为1∶1.。作为优选，步骤3)中，超声过程为：使用超声波粉碎机，在400W的功率下对混合物进行超声振荡5～8min。作为优选，步骤4)中，选用截留分子量为8000Da的透析袋透析3～5d。作为优选，步骤6)中，超声振荡为：使用超声波粉碎机，在400-600W的功率下超声振荡1～2h；离心过程为：使用冷冻高速离心机，1000～12000r/min的条件下离心15～20min。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有靶向光热效应的智能响应性纳米粒子的制备方法，其特征在于：以μmol、mmol、mL、mg和g计，包括以下步骤：1)取40～50μmol蛋黄卵磷脂和13～15μmol胆固醇琥珀酸单酯，用2～4mL三氯甲烷溶解，采用旋转蒸发法将溶剂除去，得到一层无色透亮的薄膜，真空干燥，得到干燥脂质体膜；2)取500～550mg异丙基丙烯酰胺，50～55mg N，N‑亚甲基双丙烯酰胺，5～8mg偶氮二异丁脒盐酸盐和260～280mmol硫酸铵，用5～8mL去离子水溶解，配制成水凝胶预聚物水溶液；3)通过手摇法使步骤1)所得干燥脂质体膜脱落溶解到步骤2)所得水凝胶预聚物水溶液中，在冰水浴下超声处理，形成由脂质体囊泡和纳米凝胶预聚物水溶液组成的混合溶液；4)在步骤3)所得混合溶液中加入抗坏血酸50～70mg，抽真空后通入氮气，重复3～5次；转移至氮气氛围的密封反应装置中，于45～50℃水浴中反应70～90min，并将反应后的溶液置于透析袋中透析去除未反应的杂质；5)先后用200nm、100nm孔径大小的脂质体挤出器挤出透析所得溶液，得到双敏感脂质体纳米凝胶溶液；6)取50～60mg氧化石墨烯加入50～60mL蒸馏水，在冰浴条件下超声振荡使氧化石墨片层剥落，获得棕黄色的分散液，将分散液在1000～12000r/min下离心15～25min，收集棕黄色上清液，将沉淀再次加入蒸馏水中，重复上述步骤，合并上清液得到氧化石墨烯水溶液；7)将步骤6)所得氧化石墨烯水溶液，用蒸馏水进行透析，取滤液即为纯化后的氧化石墨烯分散液；8)将步骤7)所得氧化石墨烯分散液，超声分散均匀，加入5～7g氢氧化钠、5～7g次氯酸钠，超声浴1～3h，将氧化石墨烯片层上的羟基转化为羧基；反应完全后，用稀盐酸中和并反复漂洗，经过离心处理，收集上层的黑色溶液，并用去离子水透析40～50h，除去未反应的水溶性物质；9)向步骤8)所得溶液中加入0.5～0.8g叶酸，超声分散均匀，边搅拌边加入125～127mg 1‑乙基‑(3‑二甲氨基丙基)碳化二亚胺和182.5～184.5mg氮‑羟基琥珀酰亚胺，超声2～3h后用pH＝7.8‑8.2的碳酸氢钠溶液进行透析处理，每3‑5h换一次水，40～50h后完成透析，得到黑色溶液；10)采用旋转蒸发法去除黑色溶液中的水分，用丙酮反复洗涤，真空干燥，得到叶酸修饰的氧化石墨烯；11)将步骤10)所得叶酸修饰的氧化石墨烯与步骤5)所得双敏感脂质体纳米凝胶溶液共混，避光搅拌8～12h，离心洗涤、冷冻干燥，得到最终产物。...

【技术特征摘要】
1.一种具有靶向光热效应的智能响应性纳米粒子的制备方法，其特征在于：以μmol、mmol、mL、mg和g计，包括以下步骤：1)取40～50μmol蛋黄卵磷脂和13～15μmol胆固醇琥珀酸单酯，用2～4mL三氯甲烷溶解，采用旋转蒸发法将溶剂除去，得到一层无色透亮的薄膜，真空干燥，得到干燥脂质体膜；2)取500～550mg异丙基丙烯酰胺，50～55mgN，N-亚甲基双丙烯酰胺，5～8mg偶氮二异丁脒盐酸盐和260～280mmol硫酸铵，用5～8mL去离子水溶解，配制成水凝胶预聚物水溶液；3)通过手摇法使步骤1)所得干燥脂质体膜脱落溶解到步骤2)所得水凝胶预聚物水溶液中，在冰水浴下超声处理，形成由脂质体囊泡和纳米凝胶预聚物水溶液组成的混合溶液；4)在步骤3)所得混合溶液中加入抗坏血酸50～70mg，抽真空后通入氮气，重复3～5次；转移至氮气氛围的密封反应装置中，于45～50℃水浴中反应70～90min，并将反应后的溶液置于透析袋中透析去除未反应的杂质；5)先后用200nm、100nm孔径大小的脂质体挤出器挤出透析所得溶液，得到双敏感脂质体纳米凝胶溶液；6)取50～60mg氧化石墨烯加入50～60mL蒸馏水，在冰浴条件下超声振荡使氧化石墨片层剥落，获得棕黄色的分散液，将分散液在1000～12000r/min下离心15～25min，收集棕黄色上清液，将沉淀再次加入蒸馏水中，重复上述步骤，合并上清液得到氧化石墨烯水溶液；7)将步骤6)所得氧化石墨烯水溶液，用蒸馏水进行透析，取滤液即为纯化后的氧化石墨烯分散液；8)将步骤7)所得氧化石墨烯分散液，超声分散均匀，加入5～7g氢氧化钠、5～7g次氯酸钠，超声浴1～3h，将氧化石墨烯片层上的羟基转化为羧基；反应完全后，用稀盐酸中和并反复漂洗，经过离心处理，收集上层的黑色溶液，并用去离子水透析40～50h，除去未反应的水溶性物质；9)向步骤8)所得溶...

【专利技术属性】
技术研发人员：王秉，姚舒婷，曹澳，王翠，胡智文，彭志勤，
申请(专利权)人：浙江理工大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33