一种可促肿瘤凝血和酶/pH双重响应性释药的纳米粒子及其制备方法与应用技术

本发明专利技术属于生物医用材料及药物控制释放及凝血性领域，具体涉及一种可促肿瘤凝血和酶/pH双重响应性释药的纳米粒子及其制备方法与应用。该纳米粒子具有核壳结构，核层是负载药物的碳酸钙纳米粒子，壳层是由聚乙二醇和甲基丙烯酸酐修饰的透明质酸分子经紫外光照形成的交联结构。壳层的负电性、亲水性和交联结构可提高纳米粒子的血液稳定性，透明质酸与癌细胞CD‑44受体特异性结合实现主动靶向性，纳米药物载体在肿瘤酸性环境下快速释放Ca

Preparation and application of a novel nanoparticle with dual-responsive release of thrombin and enzyme/pH in tumors

【技术实现步骤摘要】
一种可促肿瘤凝血和酶/pH双重响应性释药的纳米粒子及其制备方法与应用
本专利技术属于生物医用材料及药物控制释放领域，具体涉及一种可促肿瘤凝血和酶/pH双重响应性释药的纳米粒子及其制备方法与应用。
技术介绍
恶性肿瘤已严重威胁人类的生命健康，早期常用手术切除，而晚期大多数依靠化疗、放疗、免疫治疗等，但在杀死癌细胞的同时，也会杀死正常组织细胞，副作用大。近年提出的“饿死肿瘤”疗法为癌症治疗提供了新思路。浙医二院胡汛团队使用“饿死肿瘤”疗法，结合动脉插管化疗栓塞术和注射碳酸氢钠，封堵肿瘤血管，阻隔癌细胞糖供应，并去除乳酸对癌细胞缺糖凋亡的抑制作用，对晚期肝癌治疗有显著效果。但由于肿瘤血管很多，特别是那些细小的毛细血管，靠人工操作来精准注射碳酸氢钠和封堵血管难度很大。众所周知，Ca2+作为重要的凝血因子对促进凝血起重要作用，凝血酶原激活物在Ca2+的参与下使凝血酶原转变为有活性的凝血酶加快凝血过程。因此，如果能在肿瘤部位控制Ca2+快速释放，使肿瘤血管的Ca2+浓度增加，将可以诱发肿瘤血管凝血。CaCO3，已获美国FDA认证用于临床药剂，是一种难溶于水的碱性物质(25℃下溶解度为0.15mmol/L，升高温度溶解度下降)，但在酸性条件下溶解度大大增加。肿瘤组织由于癌细胞的糖酵解生成大量乳酸，呈明显酸性，CaCO3与乳酸反应生成水溶性的乳酸钙、CO2和H2O，可以快速释放出Ca2+，并中和乳酸的酸性。纳米粒子的血液稳定性受纳米粒子的亲疏水性和荷电性影响，带正电荷的纳米粒子容易被血管中的巨噬细胞摄取，而带负电荷和电中性的纳米粒子有利于延长血液循环时间；疏水性的纳米粒子容易表面吸附各种血浆蛋白而被网状内皮系统清除，而亲水性的纳米粒子有利于延长血液循环时间。为了提高纳米粒子在肿瘤部位的聚集，纳米粒子的癌细胞靶向性设计尤为重要，纳米粒子对癌细胞的靶向包括被动靶向和主动靶向。被动靶向是依赖渗透与滞留增强(EPR)效应来靶向癌细胞，控制纳米粒子的大小是关键，而主动靶向则是由纳米粒子表面的功能配体与癌细胞表面的某些受体特异性结合来实现靶向，比被动靶向的效率要高。一些聚合物能与癌细胞表面受体特异性结合而显示主动靶向性，如透明质酸(HA)可靶向乳腺癌细胞的CD-44、RHAMM受体，果胶可靶向肝癌细胞的ASGPR受体。肿瘤组织有着跟正常组织很不一样的环境特征，如内涵体/溶酶体呈酸性(pH～5.0)且含有丰富的透明质酸酶(Hyals)、谷胱甘肽(GSH)等。但如何通过更精准、有效且方便的思路和方法来诱发肿瘤血管凝血来快速杀死癌细胞，还有待研究与突破。
技术实现思路
为了克服现有技术不足和缺点，本专利技术的首要目的在于提供一种可促肿瘤凝血和酶/pH双重响应性释药的纳米粒子的制备方法。本专利技术的另一目的在于提供通过上述制备方法制备得到的可促肿瘤凝血和酶/pH双重响应性释药的纳米粒子。该纳米粒子以载药的碳酸钙(CaCO3)纳米粒子为核层，以聚乙二醇(PEG)和甲基丙烯酸酯(MA)修饰的透明质酸(HA)为壳层，核层和壳层通过静电相互作用复合，壳层经紫外照射形成交联结构。HA是人体细胞外基质的一种主要成分，具有良好的生物相容性，与癌细胞膜表面高表达的CD-44受体特异性识别，可以提高对肿瘤细胞的主动靶向性。HA交联可以提高纳米载体的血液稳定性，避免纳米载体在输送过程中发生解体，而PEG修饰则可以延长纳米载体的血液循环时间，避免被巨噬细胞吞噬。在肿瘤部位，碳酸钙(CaCO3)遇乳酸变成Ca2+，诱发肿瘤血管凝血，从而隔断癌细胞的糖供应，达到饿死肿瘤目的。本专利技术的再一目的在于提供上述可促肿瘤凝血和酶/pH双重响应性释药的纳米粒子的应用。本专利技术通过以下技术方案实现：一种可促肿瘤凝血和酶/pH双重响应性释药的纳米粒子的制备方法，包含以下步骤：(1)核层碳酸钙载药纳米粒子的制备①将表面活性剂、助表面活性剂和油相混合得到油相体系，然后往油相体系中先后加入可溶性钙盐溶液和可溶性碳酸盐溶液进行反应，离心，洗涤，干燥后得到碳酸钙纳米粒子；所述的可溶性钙盐溶液和可溶性碳酸盐溶液组成水相体系；②将步骤①中制得的碳酸钙纳米粒子分散在水中，然后加入药物并使之均匀分散，离心除去未负载的药物，干燥后得到碳酸钙载药纳米粒子Drug@CaCO3NPs；(2)壳层透明质酸分子的聚乙二醇和甲基丙烯酸酐修饰①将透明质酸(HA)溶于水中，加入EDC·HCl和NHS，活化HA分子链上羧基，加入甲氧基聚乙二醇胺(CH3O-PEG-NH2)使其氨基与HA分子链上的羧基进行反应，反应完成后透析，干燥后得到透明质酸-聚乙二醇聚合物(HA-PEG)；②将步骤①中制得的HA-PEG溶于水中得到HA-PEG水溶液，加入甲基丙酸烯酐(MA)，调节pH为8～9，在低温下避光反应后在水中避光透析，干燥后得到甲基丙烯酯化的透明质酸-聚二乙醇衍生物(mHA-PEG)；(3)核壳结构载药纳米粒子的制备将步骤(1)中制得的Drug@CaCO3NPs分散于水中得到分散液；将步骤(2)中制得的mHA-PEG配成水溶液，将Drug@CaCO3NPs分散液加入到mHA-PEG水溶液中，避光搅拌，加入光引发剂，紫外光照进行交联，超声振荡后离心去除残留的mHA-PEG，干燥后制得核壳结构的可促肿瘤凝血和酶/pH双重响应性释药的纳米粒子mHA-PEG/Drug@CaCO3NPs。步骤(1)①中所述的表面活性剂优选为十二烷基溴化铵(CTAB)，所述的CTAB在油相体系中的浓度优选为75mg/mL。步骤(1)①中所述的助表面活性剂优选为正丁醇。步骤(1)①中所述的油相优选为正己烷。所述的正丁醇与正己烷的体积比优选为5:27。步骤(1)①中所述混合得到油相体系的具体操作优选为在40℃下恒温搅拌至完全溶解；所述的恒温搅拌的时间优选为0.5h。步骤(1)①中所述油相体系和水相体系的体积比优选为(32:1)～(320:1)；步骤(1)①中制得的碳酸钙纳米粒子的粒径大小为50～300nm；步骤(1)①中所述的可溶性钙盐优选为氯化钙，所述的可溶性碳酸盐优选为碳酸钠。步骤(1)①中所述的可溶性钙盐溶液和可溶性碳酸盐溶液优选按钙离子与碳酸根离子的摩尔比为1:1的配比进行加入。步骤(1)①中可溶性钙盐溶液和/或可溶性碳酸盐水溶液的浓度优选为2mol/L。步骤(1)①中所述的反应优选为搅拌反应；反应的时间优选为12h。步骤(1)①中所述的洗涤优选为用分别用正己烷、乙醇洗涤三次。步骤(1)①中所述的干燥优选为烘干。步骤(1)②中所述的药物优选为抗肿瘤药物，所述的抗肿瘤药物优选为阿霉素(DOX)、拓扑替康(TPT)、紫杉醇(PTX)或其药用盐中至少一种。步骤(1)②中药物在溶液中的浓度优选为2mg/mL；碳酸钙纳米粒子在分散液中的浓度优选为1～3mg/mL。步骤(1)②中所述的药物与碳酸钙纳米粒子的质量比优选为(2:1)～(0.5:1)。步骤(1)②中所述Drug@CaCO3NPs的载药量为20％～50％；粒径大小为100～450nm。步骤(1)②中所述加入药物优选为滴入药物水溶液。步骤(1)②中所述均匀分散优选通过振荡实现，所述的振荡的时间优选为24h。步骤(1)②中所述的除去未负载的药物优选通过离心进行。步骤(2)①中所述的HA羧基与EDC·HCl本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种可促肿瘤凝血和酶/pH双重响应性释药的纳米粒子的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：(1)核层碳酸钙载药纳米粒子的制备①将表面活性剂、助表面活性剂和油相混合得到油相体系，然后往油相体系中先后加入可溶性钙盐溶液和可溶性碳酸盐溶液进行反应，离心，洗涤，干燥后得到碳酸钙纳米粒子；所述的可溶性钙盐溶液和可溶性碳酸盐溶液组成水相体系；②将步骤①中制得的碳酸钙纳米粒子分散在水中，然后加入药物并使之均匀分散，离心除去未负载的药物，干燥后得到碳酸钙载药纳米粒子Drug@CaCO3NPs；(2)壳层透明质酸分子的聚乙二醇和甲基丙烯酸酐修饰①将透明质酸溶于水中，加入EDC·HCl和NHS，活化HA分子链上羧基，加入甲氧基聚乙二醇胺CH3O‑PEG‑NH2使其氨基与HA分子链上的羧基进行反应，反应完成后透析，干燥后得到透明质酸‑聚乙二醇聚合物HA‑PEG；②将步骤①中制得的HA‑PEG溶于水中得到HA‑PEG水溶液，加入甲基丙酸烯酐MA，调节pH为8～9，在低温下避光反应后在水中避光透析，干燥后得到甲基丙烯酯化的透明质酸‑聚二乙醇衍生物mHA‑PEG；(3)核壳结构载药纳米粒子的制备将步骤(1)中制得的Drug@CaCO3 NPs分散于水中得到分散液；将步骤(2)中制得的mHA‑PEG配成水溶液，将Drug@CaCO3 NPs分散液加入到mHA‑PEG水溶液中，避光搅拌，加入光引发剂，紫外光照进行交联，超声振荡后离心去除残留的mHA‑PEG，干燥后制得核壳结构的可促肿瘤凝血和酶/pH双重响应性释药的纳米粒子mHA‑PEG/Drug@CaCO3 NPs。...

【技术特征摘要】
1.一种可促肿瘤凝血和酶/pH双重响应性释药的纳米粒子的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：(1)核层碳酸钙载药纳米粒子的制备①将表面活性剂、助表面活性剂和油相混合得到油相体系，然后往油相体系中先后加入可溶性钙盐溶液和可溶性碳酸盐溶液进行反应，离心，洗涤，干燥后得到碳酸钙纳米粒子；所述的可溶性钙盐溶液和可溶性碳酸盐溶液组成水相体系；②将步骤①中制得的碳酸钙纳米粒子分散在水中，然后加入药物并使之均匀分散，离心除去未负载的药物，干燥后得到碳酸钙载药纳米粒子Drug@CaCO3NPs；(2)壳层透明质酸分子的聚乙二醇和甲基丙烯酸酐修饰①将透明质酸溶于水中，加入EDC·HCl和NHS，活化HA分子链上羧基，加入甲氧基聚乙二醇胺CH3O-PEG-NH2使其氨基与HA分子链上的羧基进行反应，反应完成后透析，干燥后得到透明质酸-聚乙二醇聚合物HA-PEG；②将步骤①中制得的HA-PEG溶于水中得到HA-PEG水溶液，加入甲基丙酸烯酐MA，调节pH为8～9，在低温下避光反应后在水中避光透析，干燥后得到甲基丙烯酯化的透明质酸-聚二乙醇衍生物mHA-PEG；(3)核壳结构载药纳米粒子的制备将步骤(1)中制得的Drug@CaCO3NPs分散于水中得到分散液；将步骤(2)中制得的mHA-PEG配成水溶液，将Drug@CaCO3NPs分散液加入到mHA-PEG水溶液中，避光搅拌，加入光引发剂，紫外光照进行交联，超声振荡后离心去除残留的mHA-PEG，干燥后制得核壳结构的可促肿瘤凝血和酶/pH双重响应性释药的纳米粒子mHA-PEG/Drug@CaCO3NPs。2.根据权利要求1所述的可促肿瘤凝血和酶/pH双重响应性释药的纳米粒子的制备方法，其特征在于：步骤(1)①中制得的碳酸钙纳米粒子的粒径大小为50～300nm；步骤(1)②中所述的药物与碳酸钙纳米粒子的质量比为(2:1)～(0.5:1)；步骤(1)②中所述的药物为抗肿瘤药物；所述的可促肿瘤凝血和酶/pH双重响应性释药的纳米粒子mHA-PEG/Drug@CaCO3NPs的粒径大小为150～600nm。3.根据权利要求1所述的可促肿瘤凝血和酶/pH双重响应性释药的纳米粒子的制备方法，其特征在于：步骤(1)②中所述Drug@CaCO3NPs的载药量为20％～50％；粒径大小为100～450nm；步骤(2)①中所述的HA-PEG的PEG在HA高分子链上的取代度为10～30％；步骤(2)②中HA-PEG和MA的摩尔投料比为(1:1)～(1:6)；步骤(2)②中所述的mHA-PEG的MA在HA-PEG分子链上的取代度为8～25％；步骤(3)中所述的Drug@CaCO3NPs和mHA-PEG质量比为(4:1)～(1:4)。4.根据权利要求1所述的可促肿瘤凝血和酶/pH双重响应性释药的纳米粒子的制备方法，其特征在于：步骤(1)①中所述的可溶性钙盐为氯化钙，所述的可溶性碳酸盐为碳酸钠；步骤(1)①中所述的可溶性钙盐溶液和可溶...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵剑豪，李慧茹，容建华，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东,44