靶向CD133载sPD1微泡的制备方法及在制备抑制宫颈癌的药物上的应用技术

本发明专利技术涉及一种超声联合靶向CD133载sPD1微泡的制备方法，具体是将生物素化脂质微泡滴加PE标记链酶亲和素孵育，加入再加入生物素化的CD133抗体，经孵育后离心得到靶向CD133微泡。将所得的靶向CD133微泡和sPD1质粒室温下孵育后，再用PBS冲洗，离心，即可得到靶向CD133载sPD1脂质微泡。本发明专利技术将靶向CD133载sPD1脂质微泡应用于制备抑制宫颈癌移植瘤的药物上，结果表明靶向CD133载sPD1脂质微泡具体更高的抑瘤效果，靶向CD133载sPD1脂质微泡的体积抑制率和体重抑制率分别为78.01％和72.25％。

【技术实现步骤摘要】
靶向CD133载sPD1微泡的制备方法及在制备抑制宫颈癌的药物上的应用
本专利技术涉及一种脂质微泡，具体为超声联合靶向CD133载sPD1微泡，并将其应用于制备治疗宫颈癌。
技术介绍
宫颈癌是全世界女性最常见的妇科恶性肿瘤之一，发病率仅次于乳腺癌高居妇科恶性肿瘤第二位，发病率高且逐渐趋于年轻化，严重危害女性健康。宫颈癌主要是由于人乳头瘤病毒(HPV)感染造成，目前认为高危型HPV持续感染、机体的免疫功能下降及宫颈癌局部微环境之间的相互作用，促进宫颈癌的发生发展。当前治疗方法包括手术切除、放疗、化疗。手术是治疗宫颈癌的主要方法之一，虽然手术能暂时切除病灶，但肿瘤细胞具有很强的侵袭性和转移性，病灶并不能完全切除。辅助化疗在临床上被广泛用于术前和术后治疗，能够有效地降低肿瘤分期、减少宫旁浸润，为手术提供了良好的条件，但化疗的靶向性差，易产生耐药，全身毒副作用明显。宫颈癌是放射敏感性肿瘤，放疗对于中晚期患者和复发患者的效果是得到肯定的，但其严重的并发症给治疗带来极大的困难。因此探索宫颈癌的发病机制，寻找宫颈癌治疗的新靶点，对宫颈癌的早期诊断、治疗及预后评估具有重要的临床意义。
技术实现思路
针对上述技术问题，本专利技术提供一种超声联合靶向CD133载sPD1微泡，并将其应用于制备抑制宫颈癌的药物。进一步优选方案中，应用于制备抑制U14宫颈癌细胞的药物。所述的超声联合靶向CD133载sPD1微泡是通过薄膜水化法及机械震荡法制备的生物素化脂质微泡，具体步骤包括如下：(1)将二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-生物素(DSPE-PEG2000-Biotin)、硬脂酸—聚乙酰亚胺(PEI-600)混于玻璃试管中，60℃水浴锅预热后，涡旋状态下充入氮气使混合液成膜于试管壁；(二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-生物素(DSPE-PEG2000-Biotin)、硬脂酸—聚乙酰亚胺(PEI-600)，均为美国Avanti公司购买)。二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-生物素、硬脂酸—聚乙酰亚胺摩尔比75-90:3-6:3-6:2-6。优选方案中二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-生物素、硬脂酸—聚乙酰亚胺摩尔比85:5:5:5。(2)将步骤(1)中成膜后的玻璃管抽真空(抽真空3h以上，使液体充分挥发)后，加入Tris缓冲液，水浴超声(使玻璃管壁上的薄膜充分溶解于Tris缓冲液中，液体澄清后停止水浴超声)后置于西林瓶中密封，冲入C3F8气体，冷藏保存；(3)将步骤(2)中冷藏后的西林瓶经振荡后得到白色乳状液体(一般震荡25-30s)；将该白色乳状液体移经离心(在1000rpm的离心速度下离心3min)后弃去下层液体即为生物素化脂质微泡(下层液体为游离的脂质和杂质)；(4)向步骤(3)中生物素化脂质微泡滴加链酶亲和素(美国Avanti公司购买)，在2-4℃、避光下恒温振荡孵育，得到微泡混悬液；(5)将步骤(4)中的微泡混悬液离心(在1000rpm的离心速度下离心3min)后，弃去下清液(以除去游离的链酶亲和素)后，采用PBS缓冲液漂洗、离心、弃下清(优选方案为重复PBS缓冲液漂洗、离心、弃下清的步骤3次)，得到微泡；(6)将生物素化的CD133抗体(美国ebioscience公司购买)加入步骤(5)的微泡中，在2-4℃、避光的恒温振荡孵育过夜后离心(在1000rpm的离心速度下离心3min)，弃下清液(以除去游离的生物素化的CD133抗体)，加入PBS缓冲液漂洗、离心、弃下清(优选方案为重复PBS缓冲液漂洗、离心、弃下清的步骤3次)，即可得到靶向CD133微泡。(7)将所得的靶向CD133微泡和sPD1质粒(pcDNA3.1(-)-sPD1)室温下孵育，再用PBS冲洗，离心(在1000rpm的离心速度下离心3min)，除去未结合在微泡表面的sPD1质粒，得到靶向CD133载sPD1脂质微泡，即为靶向CD133载sPD1微泡。所得靶向微泡通过血球计数板计数，粒度仪测量粒径，显微镜下观察微泡形态；通过激光扫描共聚焦荧光显微镜观察。所述的PE标记链酶亲和素的加入量相对于生物素化脂质微泡过量；生物素化的CD133抗体的加入量相对于微泡过量；sPD1质粒的加入量相对于靶向CD133微泡的加入量过量。本专利技术将所制备得到的靶向CD133微泡或靶向CD133载sPD1微泡在制备抑制宫颈癌的药物上的应用。所述的靶向CD133微泡或靶向CD133载sPD1微泡在制备抑制U14宫颈癌细胞的药物上的应用。所述的靶向CD133微泡或靶向CD133载sPD1微泡的浓度为1×107-1.5×109个/ml。将所得靶向CD133载sPD1微泡与CD133高表达的Hela宫颈癌细胞共同孵育，经PBS反复洗涤后，光学显微镜下观察靶向CD133微泡在细胞水平上的靶向聚集性。将制备的靶向CD133载sPD1微泡和空微泡(未载入CD133抗体及sPD1质粒)尾静脉注射到荷瘤小鼠体内，通过超声诊断仪观察微泡在小鼠移植瘤内的超声成像效果。实施本申请的技术方案所采用的小鼠和细胞系的情况如下：SPF级BALB/c小鼠，雌性，18g左右，由三峡大学动物实验中心提供，饲养于三峡大学动物实验中心无特定病原体屏障环境中，严格SPF级实验动物操作规程。U14宫颈癌细胞瘤株，由三峡大学肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室提供。小鼠宫颈癌移植瘤的建立及分组处理从荷U14宫颈癌细胞的小鼠腹腔内抽取腹水，调整U14宫颈癌细胞浓度约2×107/ml于小鼠右前腋皮下接种0.2ml，一周后形成约0.5cm皮下肿瘤结节。将成功建立的小鼠U14宫颈癌皮下移植瘤模型，随机分为5组，每组10只：对照组、空微泡组、靶向CD133微泡、靶向CD133载sPD1微泡。根据分组给予不同种类微泡制剂的注射，每两天经尾静脉注射(0.2ml/只)及超声辐照瘤体一次，辐照条件：频率1MHZ，功率1W/cm2，占空比50％，辐照时间90s/只，其中对照组给予相同剂量的生理盐水处理，并于治疗前测量瘤体长径(a)短径(b)，按公式V＝1/2ab2计算肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线。治疗5次后处死部分小鼠，剥离瘤体，计算肿瘤体积及质量抑瘤率。剩余小鼠继续治疗，隔天每组取一只小鼠处死，取脾脏，分离脾细胞。本专利技术的试验数据采用SPSS18.0软件进行统计学分析，结果用(x±s)表示，P<0.05为差别具有统计学意义。附图说明图1靶向CD133载sPD1微泡激光共聚焦图像，其中A为可见光下微泡形态，B为PE标记(链霉亲和素)发射的红色荧光图像，C为FITC标记(抗鼠IgG)的图像，反映微泡上有CD33抗体，D为B和C图叠加。图2为PI染色的sPD-1质粒在激光共聚焦图像反映微泡载DNA的作用，其中，A为可见光下的微泡形态，B为PI染色的微泡的图像。图3靶向CD133载sPD1微泡稳定性试验。图4为靶向C本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.靶向CD133微泡的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺‑聚乙二醇2000、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺‑聚乙二醇2000‑生物素、硬脂酸—聚乙酰亚胺混于玻璃试管中，50‑60℃水浴锅预热后，涡旋状态下充入氮气使混合液成膜于试管壁；（2）将步骤（1）中成膜后的玻璃管抽真空后，加入Tris缓冲液，水浴超声后置于西林瓶中密封，冲入C3F8气体，冷藏保存；（3）将步骤（2）中冷藏后的西林瓶经振荡后得到白色乳状液体；将该白色乳状液体移经离心后弃去下层液体即为生物素化脂质微泡；（4）向步骤（3）中生物素化脂质微泡滴加链酶亲和素，在2‑4 °C、避光下恒温振荡孵育，得到微泡混悬液；（5）将步骤（4）中的微泡混悬液离心后，弃去下清液后，采用PBS缓冲液漂洗、离心、弃下清，得到微泡；（6）将生物素化的CD133抗体加入步骤（5）的微泡中，在2‑4 °C、避光的恒温振荡孵育过夜后离心，弃下清液，加入PBS缓冲液漂洗、离心、弃下清，即可得到靶向CD133微泡。

【技术特征摘要】
1.靶向CD133微泡的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-生物素、硬脂酸—聚乙酰亚胺混于玻璃试管中，50-60℃水浴锅预热后，涡旋状态下充入氮气使混合液成膜于试管壁；（2）将步骤（1）中成膜后的玻璃管抽真空后，加入Tris缓冲液，水浴超声后置于西林瓶中密封，冲入C3F8气体，冷藏保存；（3）将步骤（2）中冷藏后的西林瓶经振荡后得到白色乳状液体；将该白色乳状液体移经离心后弃去下层液体即为生物素化脂质微泡；（4）向步骤（3）中生物素化脂质微泡滴加链酶亲和素，在2-4°C、避光下恒温振荡孵育，得到微泡混悬液；（5）将步骤（4）中的微泡混悬液离心后，弃去下清液后，采用PBS缓冲液漂洗、离心、弃下清，得到微泡；（6）将生物素化的CD133抗体加入步骤（5）的微泡中，在2-4°C、避光的恒温振荡孵育过夜后离心，弃下清液，加入PBS缓冲液漂洗、离心、弃下清，即可得到靶向CD133微泡。2.靶向CD133载sPD1微泡的制备方法，其特征在于，采用权利要求1制备得到的靶向CD133微泡和sPD1质粒室温下孵育后，再用PBS冲洗，离心，即可得到靶向CD133载sPD1微泡。3.根据权利要求1所述的靶向CD133微泡或靶向CD133载sPD1微...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵云，刘朝奇，郑智唯，
申请(专利权)人：三峡大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42