本发明专利技术提供了一种嵌合抗原受体(CAR)融合蛋白，其从N端到C端包含：(i)包含VH和VL的单链可变片段(scFv)，其中scFv具有针对CD47的活性，(ii)跨膜结构域，(iii)至少一个共刺激结构域，和(iv)激活域。在一个实施方式中，scFv衍生自人源化抗CD47抗体。本发明专利技术还提供了经修饰以表达本发明专利技术的CAR的T细胞。
CD47-CAR-T cells
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】CD47-CAR-T细胞序列表、表格或计算机程序的引用序列表通过EFS-Web，以ASCII格式的文本文件同时提交，文件名为“序列表.txt”，创建日期为2018年2月8日，大小为26.1千字节。通过EFS-Web提交的序列表是说明书的一部分，并且其全部内容通过引用并入本文。专利
本专利技术涉及人源化的CD47-CAR-T细胞，其有效攻击过表达CD47肿瘤抗原的肿瘤细胞。
技术介绍
免疫疗法正在成为一种非常有前景的癌症治疗方法。T细胞或T淋巴细胞是我们免疫系统的武装力量，其不断寻找外来抗原并区分异常(癌症或感染细胞)与正常细胞。用CAR遗传修饰T细胞是设计肿瘤特异性T细胞的常用方法。靶向肿瘤相关抗原的CAR-T细胞可以输注到患者体内(称为过继性T细胞疗法)，代表了一种有效的免疫治疗方法。与化学疗法或抗体相比，CAR-T技术的优势在于重编程的工程化T细胞可以增殖并持续存在于患者体内，像活的药物一样起作用。通常，CAR(嵌合抗原受体)包括单克隆抗体衍生的单链可变片段(scFv)，其通过铰链和跨膜结构域连接至可变数量的胞内信号传导结构域和单个胞内激活CD3-ζ结构域。图1显示了CAR从第一代(左侧，没有共刺激结构域)到第二代(中间，具有一个共刺激结构域CD28或4-BB)至第三代(具有两个或多个共刺激结构域)的进化，参见Golubovskaya，Wu，癌症，2016年3月15日；8(3)。产生的具有多个共刺激结构域的CAR(第三代CAR)会引起增加的细胞溶解活性，并显著改善CAR-T细胞的持续性，表现出增强的抗肿瘤活性。CD47是免疫球蛋白超家族的细胞表面糖蛋白，其经常过表达于血液肿瘤(白血病、淋巴瘤，参见Chao等，细胞，2010,142,699–713和多发性骨髓瘤)和实体肿瘤，如卵巢癌、小细胞肺癌、胰腺腺、胶质瘤、成胶质细胞瘤、小儿脑肿瘤，和其他类型的肿瘤(Chao，同上，和Weiskopf，J.Clin。Invest.2016,126,2610–2620)。CD47也被认为是“不要吃我的信号”，通过结合SIRP-α(信号传导调节蛋白α)并阻断由SIRP介导的肿瘤细胞的吞噬作用(Weiskopf，同上)。研究显示，CD47高表达与一些肿瘤患者的不良临床结果相关，并被认为是临床预后因子。这样的肿瘤包括血液肿瘤，例如非霍奇金淋巴瘤(Chao，同上)或急性髓性白血病(Majeti等，细胞，2009,138,286-299)，以及实体肿瘤，例如卵巢癌、成胶质细胞瘤、胶质瘤等(Willingham等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA2012,109,6662–6667)。此外，研究显示，CD47信号传导在维持肿瘤起始细胞或癌症干细胞中起关键作用(Kaur等，Oncotarget，2016,7,10133-10152)。CD47在癌症干细胞中高度表达，癌症干细胞是最具攻击性的肿瘤细胞类型(Cioffi等，临床癌症研究，2015,21,2325-2337)。利用CD47，阻断CD47和巨噬细胞上的SIRPα的相互作用，诱导CD47阳性肿瘤的吞噬作用(Kim等，白血病，2012,26,2538-2545)。需要一种改进的疗效改善且毒性降低的过继性T细胞免疫疗法。附图的简要说明图1显示了第一代至第三代CAR的结构。图2显示了CD47CAR构建体的结构。图3A显示了CD47-CAR-T细胞相对T细胞和Mock-CAR-T细胞的细胞毒性。显示了来自三次独立实验的RTCA的定量。*p<0.0001CD47-CAR-T细胞相对T细胞和MockCAR-T细胞的双因素方差分析(2-wayANOVA)与Tukey’s后期测试(Tukey’spost-test)。图3B显示了CD47-CAR-T细胞以CD47依赖性方式产生IL-2；在CD47阳性细胞中高，在CD47阴性细胞中较低。效靶比E：T为1：1。条形图显示了两次独立实验中CD47CAR-T细胞IL-2分泌的平均值。*p<0.05，SKOV-3和A375细胞相对T细胞、MockCAR-T细胞、A549细胞和Hep3B细胞的学生t检验。图4A显示BxPC3胰腺癌细胞中CD47表达显著高于CD24表达。条形图显示了BxPC3细胞表达的CD24和CD47与同种型对照IgG1的MFI的平均比值±来自两次独立实验的标准差。*p＝0.029.图4B显示RTCA测定中CD47-CAR-T细胞有效杀伤BxPC3癌细胞系。图4C显示，在体外，CD47-CAR-T细胞针对BxPC3细胞分泌高水平的细胞因子：IFN-γ、IL-2和IL-6，这与图4B中所示的CD47-CAR-T细胞对BxPCR3细胞的高细胞毒性一致。来自RTCA测定的上清液用于细胞因子ILISA的测定。E：T＝10：1。*p<0.05。图4D显示CD47-CAR-T细胞显著降低BxPC3的肿瘤生长，*p＝0.006，CD47-CAR-T细胞相比于1xPBS对照。n＝4-5只小鼠，分别是CD47/CD24-CAR-T细胞和1xPBS组。图4E显示,在CD47-CAR-T细胞、CD24-CAR-T细胞和1xPBS对照组中，CAR-T细胞不影响小鼠体重。以克为单位测量小鼠体重，每周两次。图4F和图4G分别显示CD47CAR-T细胞显著降低肿瘤大小和重量。p<0.05，CD47-CAR-T细胞相比于CD24-CAR-T细胞对照和1xPBS组。成像分析小鼠肿瘤(4F)并以克为单位测量重量(4G)。图5A显示了人源化CD47ScFv的氨基酸序列。上图：小鼠B6H12抗体的CD47ScFv。下图：人源化的CD47。图5B显示ELISA证明了人源化CD47ScFv与CD47抗原的高结合活性。人PDL-1抗原为阴性对照。结合活性显著高于小鼠CD47ScFv。条形图显示了来自两次独立实验的平均结合活性。*p＝0.0025，小鼠CD47相比于PDL-1对照；**p＝0.0025，人源化CD47相比于PDL-1对照；和p＝0.0028，人源化CD47相比于小鼠CD47。图5C显示用人源化CD47ScFv和小鼠CD47ScFv对肿瘤和正常样品进行的IHC染色。观察到类似的染色情况。人源化CD47ScFv的IHC在肿瘤样品中显示高度染色，在正常组织中显示低度染色。图6A显示了用人源化CD47-CAR-T细胞，以及CD47阳性或CD47阴性Hela-CD19肿瘤靶细胞进行的RTCA细胞毒性测定。CD47-CAR-T细胞对CD47阳性Hela-CD19细胞具有细胞毒性，但对CD47阴性Hela-CD19细胞不具细胞毒性。阳性对照CD19-CAR-T细胞有效杀伤CD19阳性Hela-CD19细胞。图6B说明了RTCA测定的定量结果，其显示CD47-CAR-T细胞对CD47阳性癌细胞系具有显著增强的细胞毒性，但对CD47阴性Hela-CD19细胞没有。*p<0.001，CD47-CAR-T细胞相比于Mock-CAR-T细胞。图6C显示了人源化CD47-CAR-T细胞针对CD47阳性SKOV-3细胞的IL-2分泌。E：T比＝1：1。p<0.05，CD47-CAR-T细胞相比于对照，n＝3。图6D显示CD47-CAR本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种嵌合抗原受体融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白从N‑末端到C‑末端包含：(i)包含VH和VL的单链可变片段(scFv)，其中scFv针对CD47肿瘤抗原，(ii)跨膜结构域，(iii)CD28共刺激结构域，(iv)激活域。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2017.02.14 US 62/458,773;2017.06.13 US 62/518,767;1.一种嵌合抗原受体融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白从N-末端到C-末端包含：(i)包含VH和VL的单链可变片段(scFv)，其中scFv针对CD47肿瘤抗原，(ii)跨膜结构域，(iii)CD28共刺激结构域，(iv)激活域。2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的scFv来源于人源化CD47抗体，并包含通过接头连接的SEQIDNO：11和12所示的氨基酸序列，或与其有至少95％的序列同一性。3.如权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述人源化scFv具有SEQIDNO：13所示的氨基酸序列。4.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的scFv来源于小鼠CD47抗体，并包含通过接头连接的SEQIDNO：3和5所示的氨基酸序列，或与其具有至少95％的序...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴力军，V·戈卢鲍夫斯卡亚，
申请(专利权)人：亘喜生物科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。