本发明专利技术提供了一种CRISPR/Cas9递送系统及其制备方法和应用，所述递送系统包括金纳米簇内核、附着在金纳米簇上的CRISPR/Cas9基因编辑系统和脂质体外壳；所述CRISPR/Cas9基因编辑系统包括sgRNA和Cas9蛋白；所述Cas9蛋白连接有核定位信号肽。本发明专利技术的递送系统具有三重靶向性，实现了对CRISPR/Cas9的高效、特异性和核靶向递送，通过精准编辑Pcsk9基因，有效降低了LDL‑C水平，减少了心血管疾病风险。
A CRISPR/Cas9 Delivery System, Its Preparation Method and Application
【技术实现步骤摘要】
一种CRISPR/Cas9递送系统及其制备方法和应用
本专利技术属于生物
，涉及一种递送系统及其制备方法和应用，尤其涉及一种CRISPR/Cas9递送系统及其制备方法和应用。
技术介绍
低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)是冠心病(CHD)的关键风险因素，这是因为LDL-C可在血管内壁细胞中沉积，并加剧动脉粥样硬化的进程。尽管他汀类药物在临床应用中被广泛用作降血脂药物，但它们的治疗效果面临诸如个体差异、潜在药物相互作用的问题，导致合并症和不耐受等挑战。此外，他汀类药物需要长期服用。前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin9(Pcsk9)已被确定为治疗高胆固醇血症和预防冠心病的治疗靶点。Pcsk9是LDL受体(LDLR)的拮抗剂，特异地在肝脏表达和分泌。研究表明，敲除Pcsk9基因可显著降低LDL-C水平和CHD风险。值得注意的是，这些突变并未导致不良临床后果，这意味着针对Pcsk9的治疗将能有效且安全地治疗LDL-C诱导的CHD。靶向PCSK9的单克隆抗体在临床试验中被证明是有效的，然而，较短的作用时间和高成本限制了它们的临床应用。II型原核生物CRISPR(规律成簇的间隔短回文重复序列)/Cas9(CRISPR/Cas9)适应性免疫系统是一种尖端的基因组编辑工具箱。在单链向导RNA(sgRNA)介导下，Cas9核酸酶可特异性地靶向基因组位点并引起靶DNA序列双链断裂(DSB)，使靶基因产生移码突变。因此，CRISPR/Cas9系统在靶向基因调控中作用强大。与目前广泛使用的基因沉默方法(如siRNA或shRNA)相比，CRISPR/Cas9治疗显示出更大的潜力。首先，CRISPR/Cas9可使基因组中两个等位基因缺失，这意味着单次治疗即可在成功编辑的细胞中产生长效作用，避免了重复给药/服药；其次，CRISPR/Cas9可编辑基因组的任何部分，如内含子、外显子、启动子等，而siRNA或shRNA诱导的基因沉默仅发生在转录本中，限制了它们的应用；此外，蛋白质抑制作用不完全和siRNA/shRNA的高脱靶效应也阻碍了它们的应用。然而，在没有递送载体的帮助下，CRISPR/Cas9系统几乎不能进入哺乳动物细胞来编辑靶基因。无论是以DNA、mRNA或蛋白质的形式存在，CRISPR/Cas9系统尺寸较大，这对于递送来说是一个巨大的挑战。虽然病毒载体展现了优越的基因转染效率，但它们可能引发突变和致癌作用，再者，病毒载体可能激活免疫系统。目前常用的CRISPR/Cas9载体，包括聚合物、无机纳米颗粒(磁性纳米粒子、金纳米颗粒、碳纳米颗粒)和商业试剂(Lipofectamine2000，Lipofectamine3000)，转染效率较低，不能实现高效的基因编辑。近来，已报道了许多策略来改善CRISPR/Cas9的递送问题。例如，一种被称为iTOP(通过渗透压和丙酸甜菜碱作用的转导)的方法可使Cas9/sgRNA核糖核蛋白(RNP)在体外高效转导，但它不适用于体内。类似地，RNP可在小鼠内耳细胞中局部递送，但尚未被证实可在全身性体内递送。RGD(Arg-Gly-Asp)肽修饰的脂质体，可靶向特定细胞，但无法靶向细胞核(基因编辑的位置)。CN108342387A公开了PCSK9抑制剂类降血脂药的递送系统和生物制剂，所述脂质纳米颗粒由脂多肽分子、二油酰基磷脂酰乙醇胺、胆固醇和聚乙二醇构成，包裹Cas9mRNA和靶向小鼠及人中前蛋白转化酶枯草溶菌素9(Proproteinconvertasesubtilisin/kexintype9，PCSK9)基因保守区域的sgRNA分子。但所述递送系统需要在微流装置中制备，制备条件严格、成本较高。现有的方法不能完全满足CRISPR/Cas9系统在体内的应用，更精巧设计的递送方法显得意义重大。因此，有必要发展一种高效的递送系统，将CRISPR/Cas9特异性递送到小鼠肝脏部位，在肝细胞核内富集，并高效编辑目标基因，从而实现LDL-C的下调，降低心血管疾病的风险。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种CRISPR/Cas9递送系统及其制备方法和应用，所述递送系统实现了对CRISPR/Cas9的高效、特异性和核靶向递送，通过精准编辑Pcsk9基因，有效降低了LDL-C水平，减少了心血管疾病风险。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供了一种CRISPR/Cas9递送系统，所述递送系统包括金纳米簇内核、附着在金纳米簇上的CRISPR/Cas9基因编辑系统和脂质体外壳；所述CRISPR/Cas9基因编辑系统包括sgRNA和Cas9蛋白；所述Cas9蛋白连接有核定位信号肽。本专利技术的递送系统具有优异的转染效率和核靶向递送能力，提高了细胞对CRISPR/Cas9基因编辑系统的摄入率，具有重要的应用价值。本专利技术中，通过在Cas9蛋白的N-和C-末端修饰核定位信号肽(NLS)，增强了Cas9蛋白的核定位能力，促进了Cas9在细胞核内的富集。优选地，所述金纳米簇表面修饰有TAT多肽。本专利技术中，通过在金纳米簇表面修饰TAT多肽，不仅提高了金纳米簇的核靶向能力，而且使得金纳米簇表面带正电，有利于吸附Cas9蛋白。优选地，所述TAT多肽的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示；SEQIDNO:1所示的氨基酸序列为：CYGRKKRRQRRR.优选地，所述金纳米簇的粒径为1～5nm，例如可以是1nm、2nm、3nm、4nm或5nm，优选为2～3nm。优选地，所述sgRNA的核酸序列如SEQIDNO:2-7所示；SEQIDNO:2所示的核酸序列为：ATGCTGGGATAATTCGCTCCAGG；SEQIDNO:3所示的核酸序列为：GCCCCATGTGGAGTACATTGAGG；SEQIDNO:4所示的核酸序列为：TGGAGCGAATTATCCCAGCATGG；SEQIDNO:5所示的核酸序列为：ACTCCACATGGGGCAACTTCAGG；SEQIDNO:6所示的核酸序列为：TAATTCGCTCCAGGTTCCATGGG；SEQIDNO:7所示的核酸序列为：GGGAGCGGTCTTCCTCTGTCTGG.本专利技术的sgRNA实现了精准介导Cas9蛋白切割Pcsk9基因的效果。优选地，所述Cas9蛋白通过静电作用附着在金纳米簇表面。优选地，所述核定位信号肽的氨基酸序列如SEQIDNO:8所示；SEQIDNO:8所示的氨基酸序列为：PKKKRKV.优选地，所述脂质体修饰有半乳糖。本专利技术中，通过在脂质体表面修饰半乳糖，提高了脂质体对肝细胞的靶向性，有利于高效地将CRISPR/Cas9系统递送到肝细胞内。本专利技术中，通过在金纳米簇上修饰TAT多肽，在Cas9蛋白上连接核定位信号肽，在脂质体上修饰半乳糖，使得CRISPR/Cas9递送系统具有三重靶向性，提高了递送系统的核靶向能力和核定位能力，增强了对肝细胞的靶向性。优选地，所述脂质体由DOPE、DOTAP或胆固醇中的任意一种或至少两种的组合制备得到，优选为DOPE、DOTAP和胆固醇的组合。根据本专利技术，DOPE为二油酰磷脂酰乙醇胺，DOTAP为(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺，均为阳离子脂质体用磷脂。优选地，所述递送系统的粒径为70～150nm，例如本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种CRISPR/Cas9递送系统，其特征在于，所述递送系统包括金纳米簇内核、附着在金纳米簇上的CRISPR/Cas9基因编辑系统和脂质体外壳；所述CRISPR/Cas9基因编辑系统包括sgRNA和Cas9蛋白；所述Cas9蛋白连接有核定位信号肽。
【技术特征摘要】
1.一种CRISPR/Cas9递送系统，其特征在于，所述递送系统包括金纳米簇内核、附着在金纳米簇上的CRISPR/Cas9基因编辑系统和脂质体外壳；所述CRISPR/Cas9基因编辑系统包括sgRNA和Cas9蛋白；所述Cas9蛋白连接有核定位信号肽。2.根据权利要求1所述的递送系统，其特征在于，所述金纳米簇表面修饰有TAT多肽；优选地，所述TAT多肽的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示；优选地，所述金纳米簇的粒径为1～5nm，优选为2～3nm。3.根据权利要求1或2所述的递送系统，其特征在于，所述sgRNA的核酸序列如SEQIDNO:2-7所示；优选地，所述Cas9蛋白通过静电作用附着在金纳米簇表面；优选地，所述核定位信号肽的氨基酸序列如SEQIDNO:8所示。4.根据权利要求1-3任一项所述的递送系统，其特征在于，所述脂质体修饰有半乳糖；优选地，所述脂质体由DOPE、DOTAP或胆固醇中的任意一种或至少两种的组合制备得到，优选为DOPE、DOTAP和胆固醇的组合。5.根据权利要求1-4任一项所述的递送系统，其特征在于，所述递送系统的粒径为70～150nm，优选为90～110nm；优选地，所述递送系统的Zeta电位为20～50mV，优选为30～35mV。6.一种如权利要求1-5任一项所述的递送系统的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)将金纳米簇与连接有核定位信号肽的Cas9蛋白混合、静置；(2)加入sgRNA，混合后静置；(3)加入脂质体囊泡，混合后静置；(4)加入半乳糖苷修饰的聚乙二醇，混合后静置，得到所述递送载体。7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述连接有核定位信号肽的Cas9蛋白在宿主菌中重组表达获得；优选地，所述重组表达包括构建串联有核定位信号肽基因和Cas9蛋白基因的表达载体，将所述表达载体转化入宿主菌的步骤；优选地，所述宿主菌包括大肠杆菌；优选地，步骤(1)所述静置的时间为10～60min，优选为15～30min；优选地，步骤(2)所述静置的时间为10～60min，优选为15～30min；优选地，步骤(3)所述脂质体囊泡的制备方法包括将DOPE、DOTA...
【专利技术属性】
技术研发人员：蒋兴宇，张灵敏，郑文富，王鹏，
申请(专利权)人：南方科技大学，
类型：发明
国别省市：广东,44
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