本发明专利技术属于基因治疗技术领域，具体为用于治疗受精障碍致女性原发不孕症的制剂及其使用方法。受精障碍患者临床表现为试管婴儿术中，卵子不能受精或受精率低或多精受精，无有效胚胎，因而试管婴儿反复失败。本发明专利技术提供的用于治疗受精障碍致女性原发不孕症的制剂由一定浓度WEE2 cRNA或WEE2蛋白质配制而成。然后，给患者的卵子注射上述制剂使患者卵子成功受精或显著提高受精率，并可获得有效胚胎及最终建立妊娠。
The preparation and application method for the treatment of female primary infertility caused by fertilization obstacle
【技术实现步骤摘要】
用于治疗受精障碍致女性原发不孕症的制剂及其使用方法
本专利技术属于基因治疗
，具体涉及治疗受精障碍致女性原发不孕症的制剂及其使用方法。
技术介绍
正常受精是成功的人类生殖的关键环节。精子与卵子通过受精产生全能性合子，从而继续分化产生形成个体的所有细胞（Clift,D.,andSchuh,M.NaturereviewsMolecularcellbiology.2013.14,549-562）。因此，受精环节出现异常会导致女性不孕以及临床辅助生殖反复失败。临床中受精障碍主要包括受精率低、受精失败及多精受精。受精障碍是临床辅助生殖失败的重要原因之一。受精率低使得患者需多次取卵才可能得到极少数有效胚胎或尽管多次取卵，仍然无法获取有效胚胎。而受精失败与多精受精则使得患者完全无法获得胚胎。目前，仅一个基因突变被发现与受精失败有关（Alazamietal.TLE6mutationcausestheearliestknownhumanembryoniclethality.Genomebiology16,240）。但是此基因突变仅能解释极少数受精失败患者，我们最近发现WEE2突变存在于多个受精障碍患者中（QingSangetal.HomozygousMutationsinWEE2CauseFertilizationFailureandFemaleInfertility.AmJHumGenet.2018;102（4）:649-657）。此外，目前辅助生殖临床中，针对受精障碍患者，并无任何方法可以改善及治疗。这些患者因而无法通过自身的精子及卵子获得后代。采用供卵或供精是这些患者的唯一路径。基因治疗指通过分子生物学手段对相应基因进行补充、抑制、修复、编辑等操作，以改善及治疗相关遗传病。基因治疗方法已被用于多种疾病的治疗，包括血友病（RangarajanSetal.AAV5-FactorVIIIGeneTransferinSevereHemophiliaA.NEnglJMed.2017;377:2519-2530），脊肌萎缩症（MendellJRetal.Single-DoseGene-ReplacementTherapyforSpinalMuscularAstrophy.NEnglJMed.2017;377:1713-1722），伯氏先天性黑内障（Bainbridgeetal.Long-termEffectofGeneTherapyonLeber’sCongenitalAmaurosis.NEnglJMed.2015;372:1887-1897），高血脂症（FitzgeraldK,etal.AHighlyDurableRNAiTherapeuticInhibitorofPCSK9.NEnglJMed.2017;376:41-51）等等。但是，目前尚无任何基因治疗应用于生殖疾病的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种效果优异、操作方便的用于治疗受精障碍致女性原发不孕症的制剂及其使用方法。本专利技术研究发现，患者携带WEE2基因突变表现为不孕，辅助生殖临床中表现为卵子始终无法受精或受精卵率低及试管婴儿失败。本专利技术通过对相应患者卵子注射WEE2cRNA或WEE2蛋白，而后与精子受精，从而通过恢复突变卵子正常受精的能力，使得后续胚胎得以正常发育并形成有效胚胎及最终建立妊娠。本专利技术中，WEE2cRNA（cDNA）及WEE2蛋白的序列如SEQIDNO.1，SEQIDNO.2所示。本专利技术首先提供一种用于治疗受精障碍致女性原发不孕症的制剂，该制剂由一定浓度WEE2cRNA或WEE2蛋白质配制而成。配制过程如下：（1）WEE2cRNA制剂制备：以WEE2基因cDNA为模板通过PCR扩增WEE2的编码区（含终止密码子），纯化PCR产物并以此为模板经过SfaAI和MluI双酶切后构入载体pCMV6，用AgeI将载体单酶切，体外转录成WEE2的cRNA，并将其浓度稀释到300-1000ng/ul；WEE2cRNA制剂制备PCR扩增引物对为：hWEE2-SfaAI-F:GAGGCGATCGCCATGGATGACAAAGATATTGACAAAGAAC（SEQIDNO.3）hWEE2-TAA-MluI-R:GCGACGCGTTTAATGCAGAGGCTCACGCTCTC（SEQIDNO.4）；（2）WEE2蛋白质制剂制备：以WEE2基因cDNA为模板通过PCR扩增WEE2的编码区（含终止密码子），纯化PCR产物并以此为模板经过BamHI和XhoI双酶切后构入载体pFast-Bac1，转化DH10BacE.coli，通过蓝白斑筛选挑出阳性克隆并测序验证。Bacmid（质粒）转染Sf9昆虫细胞，获得P1代和P2代病毒。P2代病毒继续感染Sf9细胞，感染48-72小时收集细胞。超声破碎，超速离心取上清；经纯化后获得目的蛋白，调整浓度为0.5-1mg/ml。WEE2蛋白质制剂制备PCR扩增引物对为：hWEE2-BamHI-F:CGGATCCGATGGATGACAAAGATATTGACAAAGAAC（SEQIDNO.5）hWEE2-TAA-XhoI-R:GCGCTCGAGTTAATGCAGAGGCTCACGCTCTC（SEQIDNO.6）。本专利技术还提供的上述制剂的使用方法，具体步骤如下：（1）取出患者卵子，将颗粒细胞消化掉，选择MII期卵子，首先进行WEE2cRNA制剂或WEE2蛋白质制剂注射，注射浓度：WEE2cRNA为300-1000ng/ul，WEE2蛋白质制剂为0.5-1mg/ml，注射体积为5-15pL，4-5小时后再进行卵浆内单精子注射（ICSI），15-18h后观察雌雄原核形成；（2）形成原核的受精卵培养观察到第5-6天，将发育正常的囊胚活检同时冻存，染色体正常的囊胚将用于将来移植。本专利技术还涉及一种用于受精障碍致女性原发不孕患者的基因治疗方法，具体步骤包括：（1）WEE2cRNA制剂和WEE2蛋白质制剂的制备；（a）WEE2cRNA制剂制备：以WEE2基因cDNA为模板通过PCR扩增WEE2的编码区（含终止密码子），纯化PCR产物并以此为模板经过SfaAI和MluI双酶切后构入载体pCMV6，用AgeI将载体单酶切，体外转录成WEE2的cRNA，并将其浓度稀释到300-1000ng/ul；（b）WEE2蛋白质制剂制备：以WEE2基因cDNA为模板通过PCR扩增WEE2的编码区（含终止密码子），纯化PCR产物并以此为模板经过BamHI和XhoI双酶切后构入载体pFast-Bac1，转化DH10BacE.coli，通过蓝白斑筛选挑出阳性克隆并测序验证。Bacmid（质粒）转染Sf9昆虫细胞，获得P1代和P2代病毒。P2代病毒继续感染Sf9细胞，感染48-72小时收集细胞。超声破碎，超速离心取上清；经纯化后获得目的蛋白，调整浓度为0.5-1mg/ml；（2）取出患者卵子，将颗粒细胞消化掉，选择MII期卵子，首先进行WEE2cRNA制剂或WEE2蛋白质制剂注射，注射浓度：WEE2cRNA为300-1000ng/ul，WEE2蛋白质制剂为0.5-1mg/ml，注射体积为5-15pL，4-5小时后再进行卵浆内单精子注射（ICSI），15-18h后本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于治疗受精障碍致女性原发不孕症的制剂，其特征在于，该制剂由一定浓度WEE2 cRNA或WEE2蛋白质配制而成，所述WEE2基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示，所述的WEE2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；WEE2 cRNA的浓度为300‑1000ng/ul；WEE2蛋白质的浓度为0.5‑1mg/ml。
【技术特征摘要】
1.一种用于治疗受精障碍致女性原发不孕症的制剂，其特征在于，该制剂由一定浓度WEE2cRNA或WEE2蛋白质配制而成，所述WEE2基因的cDNA序列如SEQIDNO.1所示，所述的WEE2蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；WEE2cRNA的浓度为300-1000ng/ul；WEE2蛋白质的浓度为0.5-1mg/ml。2.一种如权利要求1所述制剂的使用方法，其特征在于，具体步骤为：（1）取出患者卵子，将颗粒细胞消化掉，选择MII期卵子，首先进行WEE2cRNA制剂或WEE2蛋白质制剂注射，注射浓度：WEE2cRNA为300-1000ng/ul，WEE2蛋白质制剂为0.5-1mg/ml，注射体积为5-15pL，4-5小时后再进行卵浆内单精子注射（ICSI），15-18h后观察雌雄原核形成；（2）形成原核的受精卵培养观察到第5-6天，将发育正常的囊胚活检同时冻存，染色体正常的囊胚将用于将来移植。3.一种用于受精障碍致女性原发不孕患者的基因治疗方法，其特征在于，具体步骤为：（1）WEE2cRNA制剂和WEE2蛋白质制剂的制备（a）WEE2cRNA制剂制备：以WEE2基因cDNA为模板通过PCR扩增WEE2的编码区（含终止密码子），纯化...
【专利技术属性】
技术研发人员：王磊，匡延平，桑庆，
申请(专利权)人：复旦大学，珠海复旦创新研究院，
类型：发明
国别省市：上海,31
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