本发明专利技术涉及CAR‑T细胞领域，具体而言，涉及B7‑H3抗原结合结构域的分离的结合蛋白、核酸、载体、CAR‑T细胞及其应用。本发明专利技术针对B7‑H3抗原得到的scFV片段，设计构建了用CD28或者4‑1BB为共刺激分子的第二代B7‑H3‑CAR，并且在B7‑H3阳性的非小细胞肺癌中验证了其杀伤癌细胞的能力，结果表明当T细胞与癌细胞比例为1:5时，B7‑H3‑CAR‑T仍能够非常高效的杀伤B7‑H3阳性的非小细胞肺癌细胞，并且释放出大量的I型干扰素，如IFNγ和TNFα。
【技术实现步骤摘要】
B7-H3抗原结合结构域的分离的结合蛋白、核酸、载体、CAR-T细胞及其应用
本专利技术涉及CAR-T细胞领域，具体而言，涉及B7-H3抗原结合结构域的分离的结合蛋白、核酸、载体、CAR-T细胞及其应用。
技术介绍
肺癌是全球癌症死亡率第一位的肿瘤，每年可增加大约130万新发病例，大约80-85％的新诊断的肺癌为非小细胞肺癌，如腺癌、鳞癌和大细胞癌等。中国在2017年有约80万新发肺癌病例，70万死亡肺癌病例，发病率和死亡率均占世界肺癌的40％左右，远远高于其它国家。在中国，肺癌也是发病率和死亡率双率第一的癌症，随着近年来空气污染问题的不断加重，预计未来肺癌患者的数量将进一步增加，严重影响着国人的健康和寿命。虽然早期肺癌可通过手术的方式切除肿瘤，部分患者可实现治愈，但在绝大大多数的病例当中，患者就诊时已经是晚期癌症，属于不可切除的病变或者已经出现转移，属于无法治愈的疾病状态。对于局部进展期的非小细胞肺癌患者可以接受同步放化疗，联合或不联合手术治疗，这样可以获得平均8个月的无疾病进展生存，但是5年总生存率仍小于15％。就诊时已经诊断为晚期肺癌的患者可接受新型的细胞毒治疗药物，如培美曲塞等，中位生存时间约为17个月。CAR-T(ChimericAntigenReceptorTCells的英文缩写)是一种基于基因改造的自体T细胞的免疫疗法。该疗法在提取患者的T细胞后，通过基因改造，将一种特定的蛋白----嵌合抗原受体(即CAR)表达在T细胞的表面，借此识别癌细胞表面的特异抗原，并通过这些T细胞的抗原清除能力杀死癌细胞。CAR-T治疗在目前开展的多项临床试验中取得了巨大的成功，尤其是靶向CD19和BCMA的CAR-T。虽然CAR-T治疗淋巴瘤、白血病等血液系统肿瘤已取得非常好的临床治疗效果，但CAR-T在实体瘤中的研究进展相对缓慢，其中一个重要的原因是没有合适的靶点，因为通常在实体瘤中高表达的抗原也会在一些正常组织表达。CAR-T作为最新型的革命性的免疫治疗方法在白血病中已经实现了惊人的治疗效果，如何应用于实体瘤还需要进一步地研发。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术针对B7-H3抗原得到的scFV片段，设计构建了用CD28或者4-1BB为共刺激分子的第二代B7-H3-CAR，并且在B7-H3阳性的非小细胞肺癌中验证了其杀伤癌细胞的能力，结果表明当T细胞与癌细胞比例为1:5时，B7-H3-CAR-T仍能够非常高效的杀伤B7-H3阳性的非小细胞肺癌细胞，并且释放出大量的I型干扰素，如IFNγ和TNFα。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：一方面，本专利技术提供包含B7-H3抗原结合结构域的分离的结合蛋白，其轻链可变区和/或重链可变区的氨基酸序列依次如SEQIDNO.1-2所示以及与SEQIDNO.1-2所示的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性的氨基酸序列。须知，与SEQIDNO.1-2所示的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性的氨基酸序列是由本领域技术人员能够推知通过某一个或某几个氨基酸序列变换而仍具有较好的与B7-H3抗原结合的效果。如根据实际情况，至少95％的序列同一性可以为95％、96％、97％、98％、99％等等，氨基酸发生变化的个数可以为1个、2个、3个、4个、5个、6个等等。进一步地，所述结合蛋白为scFV片段。进一步地，所述轻链可变区与所述重链可变区通过连接区连接，所述连接区的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。B7-H3是一个I型膜蛋白，在多种实体瘤中高表达，例如93.7％的胰腺癌、90.6％的乳腺癌、83％的卵巢癌、86％的直肠癌、93.8％的肝癌和70％的非小细胞肺癌，是一个肿瘤免疫治疗的新靶点。但B7-H3并不在正常组织表达，比如心脏、肺、肾脏、肝脏以及大脑等神经细胞。近年来，多个靶向B7-H3的抗体药物，包括Fc增强的抗体、同位素标记的抗体和抗体-药物偶联物等，在多个I期临床试验以及临床前的小鼠肿瘤模型研究中表现出了较好的抗肿瘤效果。这些研究结果进一步表明，设计靶向B7-H3的CAR用于实体瘤治疗是合理的，也是可行的。本专利技术经筛选得到抗B7-H3单克隆抗体2D6，其能够稳定分泌抗B7-H3的抗体。经分子生物学手段将该单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区以及两者之间的连接区克隆，其核酸序列依次如SEQIDNO.4-6所示，其氨基氨酸序列依次如SEQIDNO.1-3所示。第二方面，本专利技术提供了一种分离的核酸，所述核酸编码上述的结合蛋白。进一步地，所述轻链可变区的核酸序列如SEQIDNO.4所示。进一步地，所述重链可变区的核酸序列如SEQIDNO.5所示。进一步地，所述连接区的核酸序列如SEQIDNO.6所示。进一步地，所述核酸还连接有信号肽核酸序列。进一步地，所述信号肽的核酸序列如SEQIDNO.7所示。信号肽对应的氨基酸序列如SEQIDNO.8所示。进一步地，所述信号肽位于所述轻链可变区的氮端。本专利技术中的信号肽序列包含在PCR所使用的N-端引物中，这样扩增得到的序列中即含有信号肽。第三方面，本专利技术提供一种载体，其包含上述的核酸。进一步地，所述载体含有CD8α的铰链区、CD8α的跨膜结构域以及CD3ζ的细胞内结构域，并包含CD28或4-1BB共刺激结构域。进一步地，CD8α的铰链区、CD8α的跨膜结构域的核酸序列如SEQIDNO.9所示，其对应的氨基酸序列如SEQIDNO.10所示。进一步地，CD3ζ的细胞内结构域的核酸序列如SEQIDNO.11所示，其对应的氨基酸序列如SEQIDNO.12所示。进一步地，CD28的核酸序列如SEQIDNO.13所示，其对应的氨基酸序列如SEQIDNO.14所示。进一步地，4-1BB的核酸序列如SEQIDNO.15所示，其对应的氨基酸序列如SEQIDNO.16所示。进一步地，所述载体为慢病毒载体；所述慢病毒载体优选为pCDH-CMV-CAR-28或pCDH-CMV-CAR-BB。进一步地，所述载体中各核酸序列的连接方式如下：pCDH-CMV-B7-H3-CAR-28或pCDH-CMV-B7-H3-CAR-BB；其中，B7-H3-CAR-28的核酸序列依次为信号肽-VL-Linker-VH-CD8ɑ-CD28-CD3ζ；作为优选，B7-H3-CAR-28的核酸序列如SEQIDNO.17所示，其对应的氨基酸序列如SEQIDNO.18所示。B7-H3-CAR-BB的核酸序列依次为信号肽-VL-Linker-VH-CD8ɑ-4-1BB-CD3ζ。作为优选，B7-H3-CAR-BB的核酸序列如SEQIDNO.19所示，其对应的氨基酸序列如SEQIDNO.20所示。本专利技术提供的载体中，构建了CD28或者4-1BB作为共刺激分子的第二代B7-H3-CAR，并且在B7-H3阳性的非小细胞肺癌中验证了其杀伤癌细胞的能力，能够非常高效的杀伤B7-H3阳性的非小细胞肺癌细胞。第四方面，本专利技术提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包括上述的核酸或上述的载体。进一步地，所述宿主细胞用于表达所述核酸或载体。即该宿主细胞用于表达外源基因的细胞株。进一步地，所述宿主细胞为293细胞。293细胞是人肾上皮细胞系，有多种衍生株，比如HEK293，293T/17等。本专利技术提供的该宿本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.包含B7‑H3抗原结合结构域的分离的结合蛋白，其特征在于，其轻链可变区和/或重链可变区的氨基酸序列依次如SEQ ID NO.1‑2所示以及与SEQ ID NO.1‑2所示的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性的氨基酸序列；进一步地，所述结合蛋白为scFv；进一步地，所述轻链可变区与所述重链可变区通过连接区连接，所述连接区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
【技术特征摘要】
1.包含B7-H3抗原结合结构域的分离的结合蛋白，其特征在于，其轻链可变区和/或重链可变区的氨基酸序列依次如SEQIDNO.1-2所示以及与SEQIDNO.1-2所示的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性的氨基酸序列；进一步地，所述结合蛋白为scFv；进一步地，所述轻链可变区与所述重链可变区通过连接区连接，所述连接区的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。2.一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸编码权利要求1所述的结合蛋白；进一步地，所述轻链可变区的核酸序列如SEQIDNO.4所示；进一步地，所述重链可变区的核酸序列如SEQIDNO.5所示；进一步地，所述连接区的核酸序列如SEQIDNO.6所示；进一步地，所述核酸还连接有信号肽核酸序列；进一步地，所述信号肽的核酸序列如SEQIDNO.7所示；进一步地，所述信号肽位于所述轻链可变区的氮端。3.一种载体，其特征在于，其包含权利要求2所述的核酸。4.根据权利要求3所述的载体，其特征在于，所述载体含有CD8α的铰链区、CD8α的跨膜结构域以及CD3ζ的细胞内结构域，并包含CD28或4-1BB共刺激结构域；进一步地，CD8α的铰链区、CD8α的跨膜结构域的核酸序列如SEQIDNO.9所示；进一步地，CD3ζ的细胞内结构域的核酸序列如SEQIDNO.11所示；进一步地，CD28的核酸序列如SEQIDNO.13所示；进一步地，4-1BB的核酸序列如SEQIDNO.15所示。5.根据权利要求3所述的载体，其特征在于，所述载体为慢病毒载...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈模江，王刚，刘金超，
申请(专利权)人：北京善科生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11
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