纳米抗体及其制备方法技术

本发明专利技术提出了一种纳米抗体。该抗体：(1)具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列；或(2)与(1)相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性。根据本发明专利技术实施例的纳米抗体是特异性靶向离子通道TRPV3的抗体，能够结合天然构象的TRPV3，并且所述纳米抗体具有高水溶性、高耐性、高稳定性，高抗原结合性、低免疫原性、较强的组织穿透力以及高表达性。

Nano-antibodies and their preparation methods

The invention provides a nano-antibody. The antibody: (1) has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:1; or (2) has at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, and at least 99% identity compared with (1). According to the embodiment of the present invention, the nano-antibody is a specific target ion channel TRPV3 antibody, which can bind to TRPV3 with natural conformation. The nano-antibody has high water solubility, high tolerance, high stability, high antigen binding, low immunogenicity, strong tissue penetration and high expression.

【技术实现步骤摘要】
纳米抗体及其制备方法
本专利技术涉及生物
，具体地，本专利技术涉及纳米抗体及其制备方法和应用，更具体地，本专利技术涉及纳米抗体、分离的核酸、核酸构建体、表达载体、宿主细胞、噬菌体、药物组合物、纳米抗体在制备药物中的用途以及制备纳米抗体的方法。
技术介绍
哺乳动物的瞬时感受器电位香草素受体3(transientreceptorpotentialvanilloid，TRPV3)，作为瞬时感受器电位(transientreceptorpotential，TRP)家族的一员，是存在于细胞膜或胞内细胞器膜上的一类离子通道蛋白。研究发现，TRPV3在介导皮肤感觉、影响表皮角质细胞增殖分化、毛发生长、参与炎症反应及维持皮肤内稳态和正常功能过程中发挥重要作用。2002年，TRPV3首次在角质细胞中被发现，与TRPV1和TRPV2的同源性仅有38％和32％。TRPV3的蛋白结构包含有6个跨膜结构域，蛋白的氨基端(N末端)和羧基端(C末端)均位于胞内，由第5和第6跨膜结构域共同构成非选择性阳离子通道，主要在人体皮肤角质细胞表达。研究表明，TRPV3蛋白属于第3种热敏通道，在33℃～37℃的温度范围被激活，同时也能被一系列非热性刺激物激活，如薄荷(Peppermint)、樟脑(Camphor)、麝香草酚(Thymol)、丁香酚(Eugenol)、2-氨基乙氧基联苯硼酸盐(2-APB)和联苯硼酐(DPBA)等，此外，低pH值可明显激活TRPV3离子通道，作为非选择性阳离子通道让Ca2+进入到细胞内部。Ca2+作为非常重要的细胞内第二信使，广泛地参与信号转导过程，在肌肉收缩、神经传递、酶和激素分泌、细胞周期调控、以及细胞分化、程序死亡等多种生物活动中发挥重要作用。因此，TRPV3可调节和影响表皮角质细胞增殖分化、毛发生长、导致敏感性皮炎和角化性皮肤病的发生。近年来的研究发现TRPV3功能异常会导致Olmsted综合征和局灶型掌跖角化病等皮肤角化性疾病，也会引起酒糟鼻的皮肤炎症反应。尤其是TRPV3在细胞增殖和凋亡以及瘙痒和疼痛等感觉传导方面的作用越来越受到关注，显示了其作为单独和联合药物作用靶点在相关领域将具有较广泛的应用前景。然而TRPV3离子通道的结构复杂，由多个独立的跨膜亚基组成。结构的复杂性与多样性，使得其靶向药物的开发具有很强的挑战性。截止2015年，在预测的400多个离子通道中，只有少数几个靶点的药物被开发出来。目前，已上市或在研的离子通道药物主要为小分子化学药物和生物毒素等。然而，这些药物具有选择性较差的缺点，无法满足临床上的应用。相比较而言，抗体具有以下优势：1、特异性强，能够精准识别靶点，从而减少由于脱靶而产生的副作用；2、便于改造，通过蛋白工程的手段对抗体进行修饰，从而提高其亲和力或者优化其药代动力学特征。然而，针对离子通道靶点，迄今尚无成熟的抗体药物问世。因此，开发和获得针对离子通道靶点的抗体药物是科学家拭待解决的关键问题。
技术实现思路
本申请是基于专利技术人对以下事实和问题的发现和认识作出的：现有技术得到的TRPV3抗体多为鼠源传统抗体，抗体免疫原性强,，分子量大且结构复杂，导致抗原抗体亲和力较低，不利于靶向复杂的离子通道蛋白。其次，现有TRPV3抗体的获得多采用杂交瘤细胞技术，耗时长，成本高，且不易得到高亲和的抗体。本申请的专利技术人采用骆驼免疫与噬菌体展示技术相互结合，开发出了靶向TRPV3的高亲和纳米抗体，为治疗因TRPV3异常而导致的疾病奠定了良好的基础。为此，在本专利技术的第一方面，本专利技术提出了一种纳米抗体。根据本专利技术的实施例，所述抗体包括：(1)具有SEQIDNO：1或2所示氨基酸序列；或(2)与(1)相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性。ESGGGLVRPGGSLRLSCAASGSIFNFNNMAWYRQGPGKERELVAVSGRGGETYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCAARSRPLGDYNYWGLGTQVTVS(SEQIDNO：1)。ESGGGLVRPGGSLRLSCAASGSIFNFNNMAWYRQGPGKERELVAVSGRGGETYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCAARSRPLGDYNYWGLGTQVTVS(SEQIDNO：2)。根据本专利技术实施例的纳米抗体是特异性靶向离子通道TRPV3的抗体，能够结合天然构象的TRPV3，并且所述纳米抗体具有高水溶性、高耐性、高稳定性，高抗原结合性、低免疫原性、较强的组织穿透力以及高表达性。在本专利技术的第二方面，本专利技术提出了一种分离的核酸。根据本专利技术的实施例，所述核酸为：编码前面所述抗体的核酸或其互补序列。根据本专利技术实施例的核酸特异性编码前面所述的抗体，所述抗体能够特异性靶向离子通道TRPV3，结合天然构象的TRPV3，具有高水溶性、高耐性、高稳定性，高抗原结合性、低免疫原性、较强的组织穿透力以及高表达性。在本专利技术的第三方面，本专利技术提出了一种核酸构建体。根据本专利技术的实施例，所述核酸构建体包含：编码序列，所述编码序列为前面所述的核酸，以及可选的控制序列，所述控制序列与所述编码序列可操作地连接。根据本专利技术实施例的构建体能在宿主细胞高效表达，进而大量产生前面所述纳米抗体，有利于前面所述纳米抗体的大规模生产，易于普及和应用。在本专利技术的第四方面，本专利技术提出了一种表达载体。根据本专利技术的实施例，所述载体包含前面所述的核酸构建体。根据本专利技术实施例的构建体在特定的转染条件下可高效导入宿主细胞，整合或不整合入宿主细胞基因组，进而高效表达前面所述的纳米抗体，有利于前面所述纳米抗体的大规模生产，易于普及和应用。在本专利技术的第五方面，本专利技术提出了一种噬菌体。根据本专利技术的实施例，所述噬菌体包含前面所述的核酸、前面所述的核酸构建体或表达前面所述的纳米抗体。根据本专利技术实施例的噬菌体可将前面所述的纳米抗体在噬菌体表面融合表达出来，所述噬菌体具有与TRPV3高特异性的亲和活性。在专利技术的第六方面，本专利技术提出了一种宿主细胞。根据本专利技术的实施例，所述细胞携带前面所述的核酸构建体或前面所述的表达载体。根据本专利技术实施例的宿主细胞能够高效表达前面所述的纳米抗体，有利于前面所述纳米抗体的大规模生产，易于普及和应用。在本专利技术的第七方面，本专利技术提出了一种药物组合物。根据本专利技术的实施例，包括：前面所述的纳米抗体；以及药学上可接收的佐剂。根据本专利技术实施例的药物组合物能够特异性靶向离子通道TRPV3，结合天然构象的TRPV3，具有高水溶性、高耐性、高稳定性，高抗原结合性、低免疫原性、较强的组织穿透力以及高表达性。在本专利技术的第八方面，本专利技术提出了前面所述的纳米抗体在制备药物中的用途，所述药物用于预防或治疗TRPV3相关性疾病。前面所述的纳米抗体能够特异性靶向离子通道TRPV3，结合天然构象的TRPV3，利用前面所述的纳米抗体制备的药物能够有效预防或治疗TRPV3相关性疾病。根据本专利技术的实施例，所述TRPV3相关性疾病为手掌和足跖部位皮肤高度角化为特征的慢性皮肤病，在本专利技术的一个实施例中，所述TRPV3相关性疾病为残毁性皮肤角化病口周皮肤病(OlmstedSyndrome)或本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种纳米抗体，其特征在于，所述抗体：(1)具有SEQ ID NO：1或2所示氨基酸序列；或(2)与(1)相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性。

【技术特征摘要】
1.一种纳米抗体，其特征在于，所述抗体：(1)具有SEQIDNO：1或2所示氨基酸序列；或(2)与(1)相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性。2.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述抗体具有SEQIDNO：1所示氨基酸序列，所述抗体的框架区1具有SEQIDNO：3所示的氨基酸序列，所述抗体的框架区2具有SEQIDNO：4所示的氨基酸序列，所述抗体的框架区3具有SEQIDNO：5所示的氨基酸序列，所述抗体的框架区4具有SEQIDNO：6所示的氨基酸序列，所述抗体的互补决定区1具有SEQIDNO：7所示的氨基酸序列，所述抗体的互补决定区2具有SEQIDNO：8所示的氨基酸序列，所述抗体的互补决定区3具有SEQIDNO：9所示的氨基酸序列。3.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述抗体具有SEQIDNO：2所示氨基酸序列，所述抗体的框架区1具有SEQIDNO：10所示的氨基酸序列，所述抗体的框架区2具有SEQIDNO：11所示的氨基酸序列，所述抗体的框架区3具有SEQIDNO：12所示的氨基酸序列，所述抗体的框架区4具有SEQIDNO：13所示的氨基酸序列，所述抗体的互补决定区1具有SEQIDNO：14所示的氨基酸序列，所述抗体的互补决定区2具有SEQIDNO：15所示的氨基酸序列，所述抗体的互补决定区3具有SEQIDNO：16所示的氨基酸序列。4.一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸为：编码权利要求1～3任一项所述抗体的核酸或其互补序列，优选地，所述核酸具有SEQIDNO：17或18所示核苷酸序列。5.一种核酸构建体，其特征在于，包含：编码序列，所述编码序列为权利要求4所述的核酸，以及可选的控制序列，所述控制序列与所述编码序列可操作地连接。6.一种表达载体，其特征在于，所述载体包含权利要求5所述的核酸构建体。7.一种噬菌体，其特征在于，所述噬菌体包含权利要求4所述的核酸、权利要求5所述的核酸构建体或表达权利要求1～3任一项所述的纳米抗体。8.一种宿主细胞，其特征在于，所述细胞携带权利要求5所述的核酸构建体或权利要求6所述的表达载体，可选地，所述宿主细胞是通过转染或者转化所述核酸构建体或表达载体获得，任选地，所述宿主细胞为原核细胞；任选地，所述原核细胞为HB2151。9.一种药...

【专利技术属性】
技术研发人员：王媚娘，刘楚新，杨乃波，曹丽霞，丁权，黄谧，马莹莹，
申请(专利权)人：深圳华大生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：广东,44