本发明专利技术公开了一种抗表皮生长因子受体单链抗体、抗PD1单链抗体及融合蛋白及其应用，所述双特异单链抗体具有高度特异性的抗原识别能力，既具有抗体的特异性识别作用，同时又具有优异的抗肿瘤效果，而且该抗体融合蛋白的分子量小，可以在原核细胞表达系统中表达，大大降低了抗体药物的生产成本，具有良好的临床应用前景。
Anti-EGFR Single Chain Antibody, Anti-PD1 Single Chain Antibody and Fusion Protein
The invention discloses an anti-epidermal growth factor receptor single-chain antibody, anti-PD1 single-chain antibody and fusion protein and its application. The double-specific single-chain antibody has highly specific antigen recognition ability, not only has the specific recognition function of antibody, but also has excellent anti-tumor effect. Moreover, the molecular weight of the fusion protein of the antibody is small and can be expressed in prokaryotic cells. The expressed protein greatly reduces the production cost of antibody drugs and has good clinical application prospects.
【技术实现步骤摘要】
抗EGFR单链抗体、抗PD1单链抗体及融合蛋白
本专利技术公开了一种抗EGFR单链抗体及抗PD1单链抗体的双特异抗体，属于免疫学和分子生物学领域。
技术介绍
肿瘤是威胁人类生存最大的疾病。世界卫生组织研究显示，2012年中国癌症发病人数为306.5万，约占全球发病的五分之一；癌症死亡人数为220.5万，约占全球癌症死亡人数的四分之一。肿瘤的形成和发展具有非常复杂的调节机制，有非常多的生物效应分子参与其中。明晰这些生物效应分子的作用机制，对于肿瘤疾病的预防和治疗具有重要的意义。表皮生长因子受体是一种具有酪氨酸激酶活性的跨膜受体，普遍表达于人体的表皮细胞和基质细胞，并在多种人类恶性肿瘤中存在高表达，与恶性肿瘤的发生、发展密切相关。EGFR的高表达可以促进肿瘤细胞的增殖、血管生成、粘附、侵袭和转移。EGFR信号传导关乎细胞的凋亡、增殖、分化、迁移和细胞周期循环，与肿瘤的形成和恶化息息相关。通过阻断EGFR与其配体的结合可以抑制EGFR向胞内的信号传导，从而起到抑制肿瘤细胞生长、迁移的效果。运用免疫检测点抑制剂治疗肿瘤是一次革命性的肿瘤治疗。其中抗体阻断肿瘤细胞和T细胞之间PD-L1和PD1相互作用的治疗方式被认为是最有效和最安全的方式。PD1是I型跨膜蛋白，通常表达在T,B和NK细胞表面。它的配体PD-L1是抗原递呈共刺激分子B7家族的成员，表达在多种细胞表面，包括肿瘤细胞。当配体PD-L1与PD1结合后，PD1与TCR相互作用向细胞内传递抑制性信号。导致T细胞对肿瘤细胞无应答。如果抗体阻断了PD-L1与PD1之间的结合，则大大提高了T细胞的细胞免疫应答效率，提高了T细胞杀伤肿瘤的效率。传统的治疗肿瘤的方法是手术或者放、化疗。随着近年生物制药技术的发展，一批优质的抗肿瘤抗体药物的问世，使得一些难治性肿瘤的生存率大大提高。抗体药物已作为肿瘤患者常规的治疗药物之一，预计2020年，单抗药物的销售额将达到2000亿美元。自从1984年第一个基因工程抗体人－鼠嵌合抗体诞生以来，新型基因工程抗体不断出现，如人源化抗体、单价小分子抗体(Fab、单链抗体、单域抗体、超变区多肽等)、多价小分子抗体(双链抗体，三链抗体，微型抗体)、某些特殊类型抗体(双特异抗体、抗原化抗体、细胞内抗体、催化抗体、免疫脂质体)及抗体融合蛋白(免疫毒素、免疫粘连素)等等。另外，用于制备新型抗体的噬菌体抗体库技术成为继杂交瘤技术之后生命科学研究中又一突破性进展。对于血液性肿瘤，全分子抗体药物具有优势，它们可以激活补体和免疫细胞将血液中游走的肿瘤细胞杀死，但是对于实体肿瘤，由于全分子抗体药物分子量大，进入不到实体瘤内部，它们的抗肿瘤效果不理想。而小分子抗体却可以轻松进入实体瘤内部发挥抗肿瘤作用。未来的抗体药物将以小分子抗体药物为主。小分子抗体药物尤其对中国来说更为必须，因为在中国多发的肺癌、肝癌和消化道系统肿瘤中绝大多数都是实体性肿瘤。中国男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位，女性发病率占第二位，死亡率占第二位。而在肺癌中也有些是死亡率非常高的转移性肿瘤，如肺癌的脑转移发生率可以达到35％～50％，多个部位的骨转移发生率可以达到50％。对于脑和骨转移的癌症治疗，小分子抗体药物就可以发挥其无法替代的抑制转移作用。目前小分子抗体开发成药物主要以两种形式为主，一种是抗体偶联复合物(Antibodyconjugatecomplex，ADC)，另一种是双特异抗体。抗体-药物偶联物是一种新型的靶向治疗，比如抗肿瘤治疗中，ADCs由一个抗体或一个抗体片段ScFv连接着一个有效载荷的药物(通常是毒素)形成一个免疫复合物。抗体使这个免疫复合物结合到特定的肿瘤细胞上，通常这个免疫复合物会内化到肿瘤细胞内部，然后药物释放到细胞内引起肿瘤细胞损伤和死亡。抗体偶联复合物虽然具有很好的肿瘤识别能力和抗瘤效应，但是其制备过程中需要与另外的化学基团偶联，不仅增加了制备成本，还难以保证产物的均一性，偶联的化学基团与抗体的抗原识别区往往还容易产生空间位阻效应，有时对机体还具有毒副作用，这些因素都影响抗体偶联复合物实际的抗瘤效果。小分子抗体片段的另外一个应用方面是双特异抗体。双特异性抗体(BsAbs)就是可以识别两个不同表位的抗体。相比正常抗体，BsAbs在癌症治疗中有一些无法比拟的优势：1.BsAbs可增强特异性免疫细胞对肿瘤细胞杀伤作用。2.BsAbs可以同时作用于两种不同的通路，发挥独特或加倍的抗肿瘤作用。3.BsAbs可识别靶细胞表面两个抗原表位，增强结合能力。
技术实现思路
基于现有技术存在的问题，本专利技术的目的是研发出一种具有双重识别功能的特异性单链抗体，进而提供一种介于上述两种新型抗体药物之间的具有增强了的抗肿瘤作用的双特异抗体。基于上述专利技术目的，本专利技术首先提供了一种抗表皮生长因子受体的单链抗体，所述抗体的轻链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQIDNO.1、2和3所示，所述抗体的重链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQIDNO.5、6和7所示。在一个优选的技术方案中，所述抗体的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQIDNO.4和8所示。在一个更为优选的技术方案中，所述抗体的轻链可变区和重链可变区通过连接多肽相连，作为优选，所述连接多肽的氨基酸序列如SEQIDNO.9所示。其次，本专利技术还提供了另一种抗PD1的单链抗体。所述抗体的轻链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQIDNO.10、11和12所示，所述抗体的重链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQIDNO.14、15和16所示。在一个优选的技术方案中，所述抗体的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQIDNO.13和17所示。在一个更为优选的技术方案中，所述抗体的轻链可变区和重链可变区通过连接多肽相连，作为优选，所述连接多肽的氨基酸序列如SEQIDNO.18所示。在一个最为优选的技术方案中，所述双特异单链抗体的连接顺序为抗表皮生长因子受体单链抗体的重链可变区和轻链可变区连接抗PD1单链抗体的轻链可变区和重链可变区。在本专利技术的具体实施方式中，所述融合蛋白(双特异单链抗体)的氨基酸序列如SEQIDNO.19所示。本专利技术选取具有确定性肿瘤组织表面标记表皮生长因子受体蛋白EGFR和具有确定性T淋巴细胞抑制作用的PD1入手，利用噬菌体抗体库方法筛选高亲和力抗EGFR和PD1的ScFv，然后利用连接短肽linker将两种单链抗体串联起来，构建成双特异抗体。本专利技术将两种特异性的单链抗体用分子生物学技术串联在一起，利用其抗表皮生长因子受体一端识别肿瘤细胞，另一端利用抗PD1单链抗体识别并激活T淋巴细胞，从而达到清除肿瘤细胞的作用。本专利技术独特的专利技术构思在于将两种单链抗体串联成双特异抗体，不仅能拓宽了抗肿瘤方式，而且还增强了的抗肿瘤作用。在结合试验中，两种单链抗体均与各自的蛋白具有较高水平的亲和力，而且单链抗体与靶蛋白的结合均可以被它们相应的配体阻断。另外，双特异抗体也可以增强外周血T淋巴细胞对肿瘤细胞的非特异性杀伤。而且由于本专利技术选用的是抗体小分子片段，该双特异性抗体的分子量小，可以在原核细胞表达系统中表达，大大降低了抗体药物的生产成本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种抗表皮生长因子受体的单链抗体，其特征在于，所述抗体的轻链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、2和3所示。
【技术特征摘要】
1.一种抗表皮生长因子受体的单链抗体，其特征在于，所述抗体的轻链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQIDNO.1、2和3所示。2.根据权利要求1所述的单链抗体，其特在在于，所述抗体的重链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQIDNO.5、6和7所示。3.根据权利要求1或2所述的单链抗体，其特在在于，所述抗体的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQIDNO.4和8所示。4.根据权利要求3所述的单链抗体，其特在在于，所述抗体的轻链可变区和重链可变区通过连接多肽相连，作为优选，所述连接多肽的氨基酸序列如SEQIDNO.9所示。5.一种抗PD1的单链抗体，其特征在于，所述抗体的轻链的CDR1、CDR...
【专利技术属性】
技术研发人员：李峥，郝中禾，
申请(专利权)人：瑞菲特北京生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11
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