单核苷酸检测方法技术

一种核酸测序方法，其特征在于以下步骤：(1)通过所述核酸的渐进的焦磷酸解产生单核苷酸流；(2)通过在聚合酶和连接酶存在下使所述单核苷酸之一与相应的探针系统反应产生至少一个基本上双链的寡核苷酸已用探针，所述探针系统包含(a)第一单链寡核苷酸，其标记有处于不可检测状态的特征性可检测元件类型的第一区和第二区，所述第一区和第二区分别位于第三区的X’和Y’端侧，所述第三区包含包括捕获位点的限制性酶识别位点元件和在其X’侧的外切核酸酶阻断位点(其中X’为3’并且Y’为5’或X’为5’并且Y是3’)，和(b)第二和第三单链寡核苷酸，其能够与第一寡核苷酸上捕获位点侧翼的互补区杂交；(2a)(i)当且仅当捕获的单核苷酸包含被取代的核碱基时，用常规或切口取代依赖性限制性内切核酸酶处理所述已用探针以在所述识别位点切割所述第一寡核苷酸链，或(ii)当且仅当捕获的单核苷酸包含未取代的核碱基时，用常规或切口取代敏感性限制性内切核酸酶处理所述已用探针以在所述识别位点切割所述第一寡核苷酸链；(3)用在对应于所述第一寡核苷酸的X’‑Y’方向上具有双链外切核酸活性的酶消化已用探针的所述第一寡核苷酸链，以产生处于可检测状态的来自所述第一区，所述第二区，或所述第一和第二区的可检测元件和单链第四寡核苷酸，所述单链第四寡核苷酸至少部分是所述第一寡核苷酸的互补序列；(4)使所述第四寡核苷酸与另一个第一寡核苷酸反应以产生对应于已用探针的基本上双链的寡核苷酸产物；(5)在循环中重复步骤(2a)，(3)和(4)，和(6)检测在步骤(3)的每次重复中释放的可检测元件，其中如果使用的内切核酸酶是常规类型，则所述第二或第三寡核苷酸分别在其X’或Y’端或其附近包括引导内切核酸降解的连接。还公开了相应的生物探针系统。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】单核苷酸检测方法本专利技术涉及检测和表征单核苷酸的方法。它特别适用于DNA或RNA的测序和检测这种序列中甲基化和未甲基化核苷酸碱基的位置。遗传物质的下一代测序已经在整体上对生物科学和药物产生了重大影响，特别是因为测序的单位成本随着越来越快测序机器的上市而降低。在我们先前的申请WO2014/053853，WO2014/053854，WO2014/167323，WO2014/167324和WO2014/111723中，我们描述了一种新的测序方法，其涉及逐步消化多核苷酸分析物以产生有序的单核苷酸流，优选单个脱氧核糖核苷三磷酸的流，其中的每一个可以逐个地捕获到微滴流中的相应液滴中。此后，可以对每个液滴进行化学和/或酶促操作以显示其最初包含的特定单核苷酸。在一个实施方案中，这些化学和/或酶促操作包括涉及使用一种或多种双组分寡核苷酸探针类型的方法，每种探针类型适于能够选择性地捕获构成分析物的单核苷酸类型之一。通常，在每种这样的探针类型中，两个寡核苷酸组分之一包含特征荧光团，并且在探针未使用状态下，这些荧光团发荧光的能力由于存在靠近的淬灭剂或通过自淬灭而保持熄灭。在使用中，当探针捕获其相应的单核苷酸时，其易于进行随后的外切核酸降解，从而从淬灭剂和/或彼此释放荧光团使其能够自由发荧光。通过这种方式，可以通过分光镜手段间接地鉴定每个液滴中存在的原始单核苷酸。Fan等人在NatureReviewsGenetics7(8)632-644(2006)中提供了对方法和平台开发的一般性综述，这些方法和平台已经能够进行高度平行的基因组分析，用于基因分型，拷贝数测量，测序和检测杂合性缺失，等位基因特异性表达和甲基化。该综述的图2a示意性地显示了具有3’和5’末端的可环化探针的使用，其在分析物上的单核苷酸多态性(SNP)位点的上游和下游退火，从而留下缺口，所述缺口随后用作为SNP的互补体的核苷酸填充，形成完整的环状探针，然后其可以在释放后进行扩增。然而，与我们的方法不同，在填充过程中捕获的核苷酸不是直接从分析物本身获得。WO03080861公开了一种方法，其中核酸分析物在核苷酸特异性反应性标记存在下经历渐进的焦磷酸解，所述核苷酸特异性反应性标记在核苷酸释放时直接连接至核苷酸。这不仅与我们采用的方法完全不同，而且在实践中，当标记的核苷酸随后被查询时测量的荧光信号可能太弱而不能在相关的背景噪声之上进行可靠的鉴定。最后，WO9418218教导了一种DNA测序方法，其中分析物经历渐进的外切核酸降解以产生单核苷酸二磷酸或单核苷酸单磷酸流，然后在检测之前将其掺入荧光增强基质中。这不仅是与我们所描述的方法完全不同的方法，而且我们再次观察到所产生的任何信号可能太弱而无法可靠地检测和鉴定。在我们的申请WO2016/012789中，我们公开了在我们的上述专利申请中描述的新版本的测序方法，其涉及改进的探针系统。在该方法中，带有例如处于不可检测状态的荧光团的第一单链寡核苷酸在聚合酶和连接酶存在下经历与待捕获的核苷酸和第二和第三单链寡核苷酸的反应，以产生双链的已用探针，其中仅包含第一寡核苷酸的链易于外切核酸降解。这使得在捕获期间产生的另一条链能够参与第一寡核苷酸退火和外切核酸降解步骤的循环，使得来自释放的荧光团(现在处于可检测状态)的信号随着每个循环快速增长并且变得更容易检测。在一个实施方案中，第二和/或第三寡核苷酸的3’端通过化学修饰或优选连接各自的相关末端而对外切核酸降解具有抗性，使得当核苷酸被捕获时这些寡核苷酸所位于其中的已用探针的链呈现闭环。我们现在已经开发了本专利申请中描述的探针系统和方法的改进版本，其使得可以区分其中相关核碱基被取代或未被取代(例如甲基化或未甲基化)的核苷酸。这使得该方法特别适用于例如检测序列中甲基化胞嘧啶或腺嘌呤核碱基的位置。这是非常有益的，因为在某些情况下，已知这种甲基化的位置与遗传病症和诸如癌症的疾病相关。因此，根据本专利技术的第一方面，提供了对核酸进行测序的方法，其特征在于以下步骤：(1)通过核酸的渐进的焦磷酸解产生单核苷酸流；(2)通过在聚合酶和连接酶存在下使单核苷酸之一与相应的探针系统反应产生至少一个基本上双链的寡核苷酸已用探针，所述探针系统包含(a)第一单链寡核苷酸，其标记有处于不可检测状态的特征性可检测元件类型的第一和第二区，所述第一和第二区分别位于第三区的X’和Y’端侧，所述第三区包含包括捕获位点的限制性酶识别位点元件和在其X’侧的外切核酸酶阻断位点(其中X’为3’并且Y’为5’或X’为5’并且Y’是3’)，和(b)第二和第三单链寡核苷酸，其能够与第一寡核苷酸上捕获位点侧翼的互补区杂交；(2a)(i)当且仅当捕获的单核苷酸包含被取代的核碱基时，用常规或切口取代依赖性限制性内切核酸酶处理已用探针以在识别位点切割第一寡核苷酸链，或(ii)当且仅当捕获的单核苷酸包含未取代的核碱基时，用常规或切口取代敏感性限制性内切核酸酶处理已用探针以在识别位点切割第一寡核苷酸链；(3)用在对应于第一寡核苷酸的X’-Y’方向上具有双链外切核酸活性的酶消化已用探针的第一寡核苷酸链以产生处于可检测状态的来自第一区，第二区，或第一和第二区的可检测元件和单链第四寡核苷酸，所述单链第四寡核苷酸至少部分是第一寡核苷酸的互补序列；(4)使第四寡核苷酸与另一个第一寡核苷酸反应以产生对应于已用探针的基本上双链的寡核苷酸产物；(5)在循环中重复步骤(2a)，(3)和(4)，并且(6)检测在步骤(3)的每次重复中释放的可检测元件，其中如果使用的内切核酸酶是常规类型，则第二或第三寡核苷酸分别在其X’或Y’端或其附近包括引导内切核酸降解的连接。本专利技术方法的步骤(1)包括通过焦磷酸解从核酸分析物产生单核苷酸(此处为单核苷三磷酸)流。在该步骤中使用的分析物合适地是双链多核苷酸，其长度原则上可以是没有限制的，包括在人基因组片段中发现的高达数百万个核苷酸碱基。然而，通常多核苷酸长度至少为50，优选至少150个核苷酸对；适当地，它将大于500，大于1000，并且在许多情况下长数千个核苷酸对。尽管该方法也可用于对合成产生的RNA或DNA或全部或部分由在自然界中不常遇到的核碱基(即除腺嘌呤，胸腺嘧啶，鸟嘌呤，胞嘧啶和尿嘧啶外的核碱基)构成的其他核酸进行测序，但分析物本身适合是天然来源(例如来源于植物，动物，细菌或病毒)的RNA或DNA。这种核碱基的实例包括4-乙酰基胞苷，5-(羧基羟甲基)尿苷，2-O-甲基胞苷，5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿苷，5-羧甲基氨基-甲基尿苷，二氢尿苷，2-O-甲基假尿苷，2-O-甲基鸟苷，肌苷，N6-异戊基腺苷，1-甲基腺苷，1-甲基假尿苷，1-甲基鸟苷，1-甲基肌苷，2,2-二甲基鸟苷，2-甲基腺苷，2-甲基鸟苷，3-甲基胞苷，5-甲基胞苷，N6-甲基腺苷，7-甲基鸟苷，5-甲基氨基甲基尿苷，5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿苷，5-甲氧基尿苷，5-甲氧基羰基甲基-2-硫尿苷，5-甲氧基羰基甲基尿苷，2-甲硫基-N6-异戊烯基腺苷，尿苷-5-氧基乙酸-甲酯，尿苷-5-氧基乙酸，wybutoxosine，wybutosine，假尿苷，q核苷，2-硫胞苷，5-甲基-2-硫尿苷，2-硫尿苷，4-硫尿苷，5-甲基尿苷，2-O-甲基-5-甲基尿苷和2-O-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.核酸测序方法，其特征在于以下步骤：(1)通过所述核酸的渐进的焦磷酸解产生单核苷酸流；(2)通过在聚合酶和连接酶存在下使所述单核苷酸之一与相应的探针系统反应产生至少一个基本上双链的寡核苷酸已用探针，所述探针系统包含(a)第一单链寡核苷酸，其标记有处于不可检测状态的特征性可检测元件类型的第一和第二区，所述第一和第二区分别位于第三区的X’和Y’侧，所述第三区包含包括捕获位点的限制性酶识别位点元件和在其X’侧的外切核酸酶阻断位点(其中X’为3’并且Y’为5’或X’为5’并且Y’是3’)，和(b)第二和第三单链寡核苷酸，其能够与所述第一寡核苷酸上所述捕获位点侧翼的互补区杂交；(2a)(i)当且仅当捕获的单核苷酸包含被取代的核碱基时，用常规或切口取代依赖性限制性内切核酸酶处理所述已用探针以在所述识别位点切割所述第一寡核苷酸链，或(ii)当且仅当捕获的单核苷酸包含未取代的核碱基时，用常规或切口取代敏感性限制性内切核酸酶处理所述已用探针以在所述识别位点切割所述第一寡核苷酸链；(3)用在对应于所述第一寡核苷酸的X’‑Y’方向上具有双链外切核酸活性的酶消化所述已用探针的第一寡核苷酸链以产生处于可检测状态的来自所述第一区，所述第二区，或所述第一和第二区的可检测元件和单链第四寡核苷酸，所述单链第四寡核苷酸至少部分是所述第一寡核苷酸的互补序列；(4)使所述所述第四寡核苷酸与另一个第一寡核苷酸反应以产生对应于已用探针的基本上双链的寡核苷酸产物；(5)在循环中重复步骤(2a)，(3)和(4)，并且(6)检测在步骤(3)的每次重复中释放的可检测元件，其中如果使用的内切核酸酶是常规类型，则所述第二或第三寡核苷酸分别在其X’或Y’端或其附近包括引导内切核酸降解的连接。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.02.24 EP 16157229.21.核酸测序方法，其特征在于以下步骤：(1)通过所述核酸的渐进的焦磷酸解产生单核苷酸流；(2)通过在聚合酶和连接酶存在下使所述单核苷酸之一与相应的探针系统反应产生至少一个基本上双链的寡核苷酸已用探针，所述探针系统包含(a)第一单链寡核苷酸，其标记有处于不可检测状态的特征性可检测元件类型的第一和第二区，所述第一和第二区分别位于第三区的X’和Y’侧，所述第三区包含包括捕获位点的限制性酶识别位点元件和在其X’侧的外切核酸酶阻断位点(其中X’为3’并且Y’为5’或X’为5’并且Y’是3’)，和(b)第二和第三单链寡核苷酸，其能够与所述第一寡核苷酸上所述捕获位点侧翼的互补区杂交；(2a)(i)当且仅当捕获的单核苷酸包含被取代的核碱基时，用常规或切口取代依赖性限制性内切核酸酶处理所述已用探针以在所述识别位点切割所述第一寡核苷酸链，或(ii)当且仅当捕获的单核苷酸包含未取代的核碱基时，用常规或切口取代敏感性限制性内切核酸酶处理所述已用探针以在所述识别位点切割所述第一寡核苷酸链；(3)用在对应于所述第一寡核苷酸的X’-Y’方向上具有双链外切核酸活性的酶消化所述已用探针的第一寡核苷酸链以产生处于可检测状态的来自所述第一区，所述第二区，或所述第一和第二区的可检测元件和单链第四寡核苷酸，所述单链第四寡核苷酸至少部分是所述第一寡核苷酸的互补序列；(4)使所述所述第四寡核苷酸与另一个第一寡核苷酸反应以产生对应于已用探针的基本上双链的寡核苷酸产物；(5)在循环中重复步骤(2a)，(3)和(4)，并且(6)检测在步骤(3)的每次重复中释放的可检测元件，其中如果使用的内切核酸酶是常规类型，则所述第二或第三寡核苷酸分别在其X’或Y’端或其附近包括引导内切核酸降解的连接。2.权利要求1的方法，其特征在于所述第二寡核苷酸的Y’端和所述第三寡核苷酸的X’端通过接头区连接。3.权利要求2的方法，其特征在于所述接头区包含寡核苷酸区。4.权利要求2或3的方法，其特征在于产生的第四寡核苷酸包含闭环。5.前述权利要求中任一项的方法，其特征在于所述第二寡核苷酸(a)与捕获区的X’侧的侧翼区杂交并且(b)长于所述侧的所述区。6.前述权利要求中任一项的方法，其特征在于在所述第一寡核苷酸的3’端和所述第二或第三寡核苷酸的相应区之间存在至少一个核苷酸碱基错配。7.前述权利要求中任一项的方法，其特征在于所述可检测元件类型是荧光团类型，至少一种淬灭剂的存在使得所述荧光团类型在所述第一寡核苷酸中是不可检测的。8.前述权利要求中任一项的方法，其特征在于检测的取代的单核...

【专利技术属性】
技术研发人员：巴纳比·巴姆福思，
申请(专利权)人：贝斯四创新公司，
类型：发明
国别省市：英国,GB